Summary
Болезнь Паркинсона была связана с воздействием пестицидов. Здесь мы показываем, метод для доставки пестицидов помощью желудочного зонда на нужной концентрации и метод для анализа их влияния в альфа-синуклеина накопления в кишечной нервной системы.
Abstract
При болезни (PD) Паркинсона пациентов, сопутствующей патологии следует характерная картина с участием, в частности, кишечной нервной системы (ENS) 1,2, обонятельной луковице (OB), спинной ядра двигатель блуждающего (DMV) 3, intermediolateral ядре спинного мозга и 4 черной субстанции, что обеспечивает основу для постановки нейропатологических заболевания 4,5. ENS и ОВ наиболее подверженных нервных структур и первыми пострадают. Интересно, что PD было связано с пестицидами 6-8. Здесь мы показываем, подробно двух методов, используемых в нашем предыдущем исследовании 9. Для того чтобы проанализировать последствия ротенон действовать локально на ENS, мы вводить ротенон помощью желудочного зонда до одной летний C57/BL6 мышей. Ротенон является широко используются пестициды, что сильно тормозит митохондриального комплекса I 10. Очень липофильными и плохо всасывается в желудочно-кишечном тракте 11. Наши результаты показали, что введение 5 мг / кг ротенон не ингибирует митохондриальный комплекс Я активности в мышцах или головном мозге. Таким образом, предполагая, что с помощью нашего метода администрации ротенон не пересекали портальный системы и действовал исключительно на ENS. Здесь мы показываем, метод для управления использованием пестицидов зонд и протокола анализа изображений используется для анализа воздействия пестицидов в альфа-синуклеина накопления в ENS. Первая часть показывает метод, который позволяет внутрижелудочного введения пестицидов (ротенон) на желаемую точные концентрации. Второй метод показывает, полуавтоматическая анализа изображений для анализа протоколов альфа-синуклеина накопления в ENS использованием программного обеспечения для анализа изображений.
Protocol
1) внутрижелудочного введения Ротенон
- Взвесьте животных.
- Рассчитать общий объем ротенон / транспортное средство решения необходимо. В этом случае 0,01 мл на грамм веса животного.
- Зарядка 1 мл шприц с ранее расчетный объем ротенон решение (0,625 мг / мл ротенон, 4% карбоксиметилцеллюлозы и 1,25% хлороформ) или транспортное средство решения (4% карбоксиметилцеллюлозы и 1,25% хлороформа). В данном случае это соответствует 5 мг / кг ротенон дозы.
- Возьмите мышь и, держа хвост мыши с одной стороны, растягивать кожу шеи, потянув ее с первыми двумя пальцами другой руки.
- Как только голова фиксируется между двумя пальцами, постное ее от ладони и поверните ее вверх тормашками. Закрепите хвост использованием четвертого и пятого пальцев.
- Хранение головой в сторону спины, пресса небо открывать рот мыши. Аккуратно ввести зонд в рот. Важно использовать зонд иглой, а не регулярные иглы. Медленно, перемещать зонд в направлении желудка достаточно далеко. Это позволит избежать материала попадая в легкие.
- Администрирование решение ротенон или транспортное средство, слегка нажав эмболии. После завершения строительства, медленно извлекать зонд.
- Место животное обратно в другой клетке, пока все животные из одной клетки сделаны.
2) Порядок Иммуноокрашивание
- После лечения, мышей под наркозом кетамин использованием 100 мг / кг унд Xylazin 10 мг / кг и intracardially озарен 4% Параформальдегид в PBS.
- Кишках извлекаются путем рассечения, и помещен в 15% сахарозы в одночасье. На следующий день, ткани передается до 30% сахарозы и инкубировали еще в течение ночи при 4 ° C.
- Ткани затем помещаются в ткани-тек и хранится в -80 ° C морозильнике до использования.
- Использование криостата, 20 микрон кишечника сечения передаются SuperFrost слайдов.
- Блокировка и иммунной процедур с использованием анти-βIII-тубулина и анти-альфа-синуклеина антитела Затем выполняется, как описано выше 9.
3) Альфа-синуклеина Включение анализа изображений
Рекомендуется, чтобы внешний человек не знают о происхождении образов »выполняет анализ. Таким образом, данные должны быть кодифицированы. Анализ изображений проводили с использованием ФИДЖИ программного обеспечения.
- Открытое конфокальной файл образа. Затем разделить каналы, так что можно работать по каждому каналу отдельно.
- Закрыть эти каналы, которые не будут использовать и выберите Анализ> Установить масштаб и набор Размер пикселя к 1. Установить известно расстояние до 0,13 (это будет зависеть от объективных и используемого разрешения) и нажмите на глобальном. Размер изображения теперь будет показано в микронах.
- Выберите альфа-канал синуклеина и выберите ганглия, убедитесь, что выбор охватывает ганглия во всех ломтиками.
- Пресс Изображение> Дублировать дублировать изображение. С ганглия выбрана, только изображение размером ганглия будут продублированы.
- Пресс Edit> Clear Outside. Часть изображения за пределами выделенной области станет черным.
- Дублируйте изображение снова, чтобы определить на последующих этапах, насколько хорошо процедуру пошел. Изображения, которые имеют высокий сигнал-шум на фоне отношения не должны использоваться для анализа изображений.
- Выберите Image> Adjust> Threshold и выберите MaxEntropy. Затем переходите на ломтики в обрезанное изображение и исходная для того, чтобы процедура прошла хорошо. Энтропийный порог выбирает уровень интенсивности сигнала на основе гистограммы изображения и только те пиксели с интенсивностью выше этого порога будет отображаться в белых над черными изображения.
- Выберите процесс, а затем нажмите Гладкий. Этот шаг превращает pixeled краев изображения в гладкими краями.
- Выберите процесс, а затем нажмите Binary, и выберите Сделать Binary. Изображение будет отображаться как черный на белом изображении.
- Дублируйте изображение выполнить следующий шаг на дублируются изображения.
- Нажмите на анализ> Анализ частиц. Затем выберите Показать: Очерки и нажмите на итоги. Остальные параметры должны быть листьями по умолчанию. Эта функция распознает общее количество пикселей с отношением сигнал, и те, которые сгруппированы вместе. Общей площади пикселей с сигнала и число групп пикселей и среднего размера, как сообщается.
- Сравните и выберите крупнейших срез, который регулирует хорошо. Ломтик будут отмечены.
- Скопируйте данные таблицы с общей альфа-синуклеина поверхность, число включений и средний размер частиц. Вставьте данные в таблицу Excel или аннотированного в другом месте.
- Вернуться на Фиджи и найти ранее выбранный срез в β-тубулина канал, и выберите его.
- Выберите область ганглии и нажмите на анализ, затем выберите мер. В другой таблице появятся показывающиеобщей площадью ганглия.
- Извлечение данных из таблицы Excel листа около альфа-синуклеина измерение или скопируйте ее вниз, в другом месте.
- Использование Excel, разделить различные параметры, полученные в альфа-синуклеина измерение ганглия поверхности, чтобы получить общую альфа-синуклеина поверхности и включение число нормированных ганглия размера.
4) Результаты представитель
Когда зонд протокола администрации выполняется правильно неудобства для животных, являются минимальными. Лечение с помощью этой концентрации ротенон позволяет местным действием ротенон на ENS без ротенон в крови и не торможение мышцы или мозга митохондриального комплекса I даже после 1,5 месяцев лечения (см. рисунок 1). Если анализ изображений выполняется правильно тщательный анализ альфа-синуклеина картина должна быть возможной. Это дает надежные данные об общем количестве альфа-синуклеина (общая площадь), альфа-синуклеина узор в клетку (количество включений) и наличие альфа-синуклеина включений (включение размера) (рис. 2).
Рисунок 1. Двигатель дисфункции у ротенон мышей без обнаружения ротенон в крови или ЦНС. , Стандартная (50 нг / мл) и хроматограммы из мозга образцы 20, 10 и 5 мг / кг мышей. В и С, количественное ротенон в крови (В) и ЦНС (С). B, крови 1 , 2 и 3 часа после обработки. Мыши были разделены на три группы (п = 3) и обрабатывают 2,5, 5, 10 и 20 мг / кг ротенон (п = 3), 300 мкл крови было добыто 1, 2 и 3 часа после ротенон администрации и объединенных вместе для ВЭЖХ анализа. C, мышей лечили в течение одной недели один раз в день с 5 (п = 3), 10 (п = 3) и 20 (п = 1) мг / кг ротенон, головного мозга и ствола мозга было добыто 1 и 2 часа после последний администрации и подготовлены для ВЭЖХ анализа. D, митохондриальная Комплекс I активности в мышцах и мозге образцов 1,5 месяца мышей.
Рисунок 2. Локально управляемый ротенон вызывает альфа-синуклеина фосфорилирования, накопления и агрегации с глиоз в ганглиях ENS. (Масштаб баров 20 мкм)., В, С, анти βIII-тубулина, альфа-синуклеина и DAPI окрашивание в двенадцатиперстной кишке (Б) и подвздошной кишки ( , С) секций. Стрелка в В, 1,5 месяца лечения индуцированной увеличился альфа-синуклеина точечным рисунком внутри кишечных нервных ганглиях системы по сравнению с 3-х месяцев управления (). Стрелка на С, 3-х месяцев лечения индуцированной образование более крупных альфа-синуклеина включений (диаметром> 6 мкм). D, иммунофлуоресцентного метода с использованием анти-альфа-синуклеина, Thioflavine S и DAPI. Стрелка в D, только 3 месяца мышей показало, агрегация этих больших альфа-синуклеина накоплений. E, E ', E'', изображение шаги анализ количественного определения. E, пример изображения, используемого в количественном показывает ганглия ENS immunostained против альфа синуклеина показывающие различных включений. E ', например изображения, полученные после анализа протоколов изображения. E'', перекрытия между некоторыми из оригинальных включений (зеленый) и представление, полученное после выполнения протокола (желтые линии). Ф.Г., количественную оценку эксперимента показана на AC было сделано с помощью автоматических сегментации и энтропии методов, основанных на порог. Single-звездочкой, P <0,05, и дважды звездочкой, P <0,01. F, каждый столбец представляет общую альфа-синуклеина поверхности / ганглия поверхности. G, каждый столбец представляет общее количество альфа-синуклеина включений / ганглия поверхности. Все графики показывают среднее ± SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Внутрижелудочного введения была ранее выполнявшего 12. Однако, по рукописи Inden, в ротенон вводили растворенный в 0,5% соли карбоксиметилцеллюлозы натрия (CMSS) в одиночку. Ротенон является высокая liphophylic вещества. Таким образом, ротенон не может быть распущен в 0,5% CMSS в одиночку и будет осадок, если сделали это. Использования хлороформа создает равномерно распределенные ротенон подвески избежать осадки. Более того, из-за более высокой концентрации пестицидов в CMSS, окончательный объем вводимого раствора также значительно сократилось. Таким образом, снижение осложнений в администрации.
Мы рекомендуем использовать прямые gavages. Пищевода мышь прямо, заканчивая непосредственно на одной стороне живота. Таким образом, прямые gavages более адекватны для этой задачи.
Анализ изображений конфокальных изображений было сделано с использованием ФИДЖИ программного обеспечения. Плагинов для этой программы можно скачать в Интернете. Иммунофлуоресцентного окрашивания для анализа изображения было выполнено, как описано выше 9. Изображения были получены с помощью LSM 510 Zeiss конфокальной микроскопии. Важно, что изображения полученные с помощью такой же сигнал / шум. Это может быть достигнуто путем регулировки усиления и смещения до приобретения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Пан-Франциско Montojo имеет патент на рассмотрении в течение этой животной модели (Номер заявки PCT / EP 2009/005688).
Acknowledgments
Барри Педро де ла Маса Фонд поддержал эту работу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Germany |
| Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Germany |
| Carboxymethylcellulose | Sigma-Aldrich | C5678 | Germany |
| Gavage 1,2 mm x 60 mm | Unimed | Switzerland | |
| LSM 510 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FIJI | http://pacific.mpi-cbg.de |
References
- Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).
- Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system. Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).
- Wakabayashi, K. Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism. J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).
- Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons. Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).
- Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).
- Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living. Neurology. 50, 1346-1350 (1998).
- Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals. Neurology. 42, 1328-1335 (1992).
- Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease. Neurology. 43, 1150-1158 (1993).
- Pan-Montojo, F. Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice. PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).
- Sherer, T. B. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).
- Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. Toxin-induced models of Parkinson's disease. NeuroRx. 2, 484-494 (2005).
- Inden, M. Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone. J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).
