鱼藤酮灌胃和图像分析α- synuclein的夹杂物在肠道神经系统的一个使用口服

Summary

帕金森氏病已经涉及到农药的暴露。在这里，我们显示一个方法来提供所需浓度和方法来分析在α- synuclein的积累，在肠神经系统的影响农药的使用胃管。

Abstract

在帕金森氏病（PD）患者中，相关的病理如下特征的模式，特别是肠神经^系统 （ENS）1,2，嗅球（OB），迷走^{“（DMV）3}的背运动核，中间外侧脊髓⁴和黑质核，提供^4,5疾病的神经病理分期的基础。的ENS和OB的最暴露的神经结构，首当其冲受到影响的。有趣的是，PD已经涉及到农药暴露^6-8。在这里，我们详细显示在我们以前的研究⁹中使用的两种方法。为了分析的ENS本地的鱼藤酮的影响，我们使用一岁C57/BL6小鼠灌胃管理鱼藤酮。鱼藤酮是一种广泛使用的农药，强烈抑制线粒体复合物I ^10。它是高度lipophylic和¹¹在胃肠道吸收不良。我们的研究结果表明，5毫克/公斤鱼藤酮的管理并没有抑制线粒体复合物我的肌肉或大脑的活动。因此，这表明，我们的管理方法，鱼藤酮没有跨hepatoportal系统，是单纯的ENS行事。在这里，我们显示的方法来管理农药使用灌胃和图像分析协议，用来分析在α-突触核蛋白在ENS的积累农药的影响。第一部分显示了一个方法，使所需的精确浓度的农药（鱼藤酮）灌胃。第二种方法演示半自动图像分析协议分析α-突触核蛋白在ENS的积累，使用图像分析软件。

Protocol

1）鱼藤酮灌胃

1. 称量动物。
2. 计算总量的鱼藤酮/车辆所需的解决方案。在这种情况下，每克动物体重0.01毫升。
3. 与以前计算的鱼藤酮溶液体积（0.625毫克/毫升鱼藤酮，4％的羧甲基纤维素钠和1.25％，氯仿）或车辆的解决方案（4％羧甲基纤维素钠和1.25％，氯仿），充电1 mL注射器。在这种情况下，对应于5毫克/公斤的鱼藤酮剂量。
4. 拿起鼠标，一只手​​握住鼠标的尾部，舒展，另一方面与前两个手指拉颈部的皮肤。
5. 一旦头部是固定的两根手指之间，靠在手掌，并把它上下颠倒。修正使用第四个和第五个手指的尾巴。
6. 保持对后面的头，按上腭，打开鼠标的嘴。轻轻地引入口灌胃。重要的是要使用一个灌胃针，而不是一个普通的针。慢慢地，在胃远远不够的方向移动灌胃。这将避免材料在肺部获得。
7. 鱼藤酮溶液或车辆管理轻轻按下栓子。完成后，慢慢地提取物灌胃。
8. 从一个笼子里的所有动物都将在另一个笼子里的动物，直到完成。

2）免疫染色程序

1. 治疗后，小鼠的麻醉使用氯胺酮100毫克/公斤和Xylazin 10毫克/公斤的IP和intracardially灌注4％多聚甲醛的PBS。
2. 的胆量，然后由夹层中提取，放置过夜，并在15％的蔗糖。第二天，组织转移30％的蔗糖和4℃过夜孵育° C。
3. 组织，然后放置在组织- TEK，并储存在-80℃冷冻，直到使用。
4. 使用低温恒温器，20微米肠道截面转移到Superfrost幻灯片。
5. 阻塞和使用反βIII-微管蛋白和抗-α-突触核蛋白抗体的免疫程序，然后^执行 9如前所述。

3）α-突触核蛋白共享图像分析

建议外部图像“出身的人不知道执行的分析。因此，该数据应该加以编纂。使用斐济软件进行图像分析。

1. 打开的共聚焦图像文件。然后，分裂的渠道，因此，它是可以对每个通道的独立工作。
2. 关闭这些渠道，不会使用和选择分析>设置规模和像素的大小设置为1。已知的距离设置为0.13（这将取决于客观和使用的决议），点击全球。现在将显示图像的大小在微米。
3. 选择α- synuclein的通道，并选择“节”，确保选择在所有切片的神经节封闭。
4. 按“图像”>“重复重复的图像。随着节选定的，只是一个形象的神经节的大小将被复制。
5. 按“编辑”>“清除外。选定区域之外的形象的一部分将变成黑色。
6. 再次重复的形象，在后面的步骤，程序，以确定。图像具有较高的信号噪声背景的比例不应该用于图像分析。
7. 选择图像>调整>阈值，然后选择MaxEntropy。然后移到裁剪图像和原片，以确保过程顺利。熵阈值选择一个基于图像的直方图，只有那些与强度高于此阈值将在白色比黑色图像显示的像素的亮度信号电平。
8. 选择过程，然后在平滑。这一步变换的图像边缘平滑pixeled的边缘。
9. 选择过程，然后对二进制，并选择二进制。图像将显示为黑色比白色图像。
10. 重复的图像复制的图像上执行下一步。
11. 点击颗粒分析>分析。然后选择“显示：”“纲要”，并点击总结。其余的设置应在默认阔叶。此功能承认一个信号，这些组合在一起的像素总数。总表面的信号加像素的群体数量和平均粒径的像素。
12. 比较和选择最大的片，调整好。切片将被标记。
13. 复制数据表与总α-突触核蛋白的表面，夹杂物的数量和平均粒径。粘贴到Excel电子表格或其他地方注明数据。
14. 返回斐济，并找到先前选定的切片中的β-微管蛋白通道，并选择它。
15. 选择神经节区域，然后单击分析，然后选择测量。另一个表中会出现显示总表面的神经节。
16. 从表中提取数据到Excel工作表的α-突触核蛋白的测量附近或其他地方将它复制下来。
17. 使用Excel，划分由神经节表面的α-突触核蛋白测量不同的参数，以获得总α-突触核蛋白的表面和包容的节大小归。

4）代表性的成果

当灌胃给药协议是正确执行动物的不便是微乎其微的。治疗这种鱼藤酮的浓度，使没有血液中的鱼藤酮水平上的ENS当地的鱼藤酮作用，并没有抑制肌肉或脑线粒体复合物，我什至1.5个月的治疗后（见图1）。如果图像分析是正确执行严格的分析的α-突触核蛋白的格局应该是可能的。它提供可靠的数据，对α-突触核蛋白（总表面积），α-突触核蛋白在细胞模式（夹杂物的数量）和存在的α- synuclein的夹杂物（包含大小）（图2）的总金额。

图1。汽车没有检测鱼藤酮在血液或中枢神经系统功能障碍在鱼藤酮治疗的小鼠。 一，标准（50毫微克/毫升），并从20，10和5毫克/公斤治疗的小鼠的大脑样品的色谱图，B和C，血液中的鱼藤酮的水平（B）和CNS（三）量化，B，血药浓度1治疗后，2日和3小时。小鼠被分为三组（N = 3），2.5，5，10和20毫克/公斤鱼藤酮治疗组（n = 3），300μL的血液中提取1，2和3小时后，鱼藤酮管理和汇集为高效液相色谱法分析C，小鼠治疗一个星期一次5（N = 3），10（N = 3）和20天（N = 1）毫克/公斤的鱼藤酮，脑和脑干中提取1和2小时后末次给药和高效液相色谱分析D，线粒体复合物我1.5月治疗的小鼠的肌肉和大脑样本中的活动准备。

图2。本地管理的鱼藤酮诱导α-突触核蛋白磷酸化，积累和聚集在ENS的神经节胶质细胞增生（比例尺20 微米），A，B，C，抗βIII-微管蛋白，α-突触核蛋白和十二指肠的DAPI染色（二）和回肠（ A，C）节。 在 B箭，1.5个月的治疗诱导增加α-突触核蛋白肠神经系统神经节内的点状模式相比，3个月控制（ 一 ） 。箭，治疗3个月诱导形成较大的α- synuclein的夹杂物（O> 6 微米 ） 在 C，D，免疫荧光染色使用抗-α-突触核蛋白，硫黄素小号和DAPI染色。箭在 D中，只有3个月治疗的小鼠表明这些较大的α-突触核蛋白积累聚合，E，E'，发送“，图像分析定量步骤，E，例如使用的图像显示一个ENS的神经节的量化阿尔法synuclein的免疫染色对显示地 ，定量实验显示在不同的夹杂物。E“，例如图像分析协议后获得的图像，E”，一些原来的夹杂物（绿色）和执行协议（黄线）后获得的代表性之间的重叠。 交流是使用自动分割和基于熵的阈值方法。单星号<0.05，双星号，P <0.01。楼 ，每一列代表总α- synuclein的表面/节表面，G，每一列代表总数的α- synuclein的夹杂物/节表面。所有图表显示平均± SEM

Discussion

灌胃给药先前已执行^12。然而，因登的手稿，鱼藤酮管理溶解在0.5％的羧甲基纤维素钠（CMSS）单。鱼藤酮是一种高liphophylic物质。因此，鱼藤酮不能被溶解在0.5％的CMSS单独会沉淀，如果这样做的。氯仿的使用创建一个均匀分布的鱼藤酮悬浮，避免沉淀。此外，由于在CMSS农药的浓度较高，管理解决方案的最终体积也明显下降。因此，减少并发症的管理。

我们建议使用直gavages。食道鼠标是直的，直接作用于胃的一侧结束。因此，直gavages这个任务更充足。

斐济软件，使用共聚焦图像图像分析。此软件的插件，可以在线下载。免疫荧光染色图像分析⁹如前所述。使用一个LSM的510蔡司共聚焦显微镜获得的图像。重要的是，图像使用相同的信号/噪声比收购。这样就可以实现通过调整增益和收购前的偏移。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Germany
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Germany
Carboxymethylcellulose	Sigma-Aldrich	C5678	Germany
Gavage 1,2 mm x 60 mm	Unimed		Switzerland
LSM 510	Carl Zeiss, Inc.
FIJI	http://pacific.mpi-cbg.de