Summary
Parkinsons sjukdom har varit relaterad till exponering för bekämpningsmedel. Här visar vi en metod för att leverera bekämpningsmedel med hjälp av en sond på önskad koncentration och en metod för att analysera deras effekt på alfa-synuklein ackumulering i det enteriska nervsystemet.
Abstract
Vid Parkinsons sjukdom (PS) patienter följer tillhörande patologi ett karakteristiskt mönster med bland annat det enteriska nervsystemet (ENS) 1,2, luktbulben (OB), den dorsala motoriska kärna vagus (DMV) 3, den intermediolateral kärna av ryggmärgen 4 och substantia nigra, som ger grunden för neuropatologiska stadieindelning av sjukdomen 4,5. ENS och OB är de mest utsatta nervös strukturer och de första som påverkas. Intressant nog har PD satts i samband med bekämpningsmedel exponering 6-8. Här visar vi i detalj två metoder som används i vår tidigare studie 9. För att analysera effekterna av rotenon agerar lokalt på ENS, administrerade vi rotenon med en sondmatning till ett år gamla C57/BL6 möss. Rotenon är ett vanligt bekämpningsmedel som starkt hämmar mitokondriernas Complex I 10. Det är mycket lipophylic och absorberas dåligt i mag-tarmkanalen 11. Våra resultat visade att administrering av 5 mg / kg rotenon inte inhiberar mitokondriellt Complex Jag aktivitet i muskler eller hjärnan. Således antyder att använda vår rotenon administration metoden inte korsa hepatoportal systemet och agerade enbart på ENS. Här visar vi en metod att administrera bekämpningsmedel med hjälp av en sondmatning och bildanalys protokoll som används för att analysera effekterna av bekämpningsmedel i alfa-synuklein ackumulering i ENS. Den första delen visar en metod som tillåter intragastriskt tillförsel av bekämpningsmedel (rotenon) vid en önskad exakt koncentration. Den andra metoden visar en halvautomatisk protokoll bildanalys för att analysera alfa-synuklein ackumulering i ENS att använda en mjukvara bildanalys.
Protocol
1) intragastriskt Administration av Rotenon
- Väg djuret.
- Beräkna den totala volymen av rotenon / fordon som behövs lösning. I detta fall 0,01 ml per gram djurets vikt.
- Ladda en 1 ml spruta med den tidigare beräknade volymen rotenon lösning (0,625 mg / ml rotenon, 4% karboxymetylcellulosa och 1,25% kloroform) eller fordon-lösning (4% karboxymetylcellulosa och 1,25% kloroform). I detta fall motsvarar en 5 mg / kg rotenon dos.
- Plocka upp musen och hålla musens svans med ena handen och sträcka huden på halsen genom att dra den med de första två fingrar i den andra handen.
- När huvudet är fast mellan två fingrar, luta den mot handflatan och vända den upp och ned. Fäst svansen med hjälp av det fjärde och femte fingrar.
- Håll huvudet bakåt, tryck på gommen att öppna musen mun. Försiktigt införa sondmatning i munnen. Det är viktigt att använda en sondmatning nål och inte en vanlig nål. Sakta, flytta sondmatning i riktning mot magen tillräckligt långt. Detta för att undvika material att få i lungorna.
- Administrera rotenon lösning eller fordonet genom att försiktigt trycka på emboli. När det är klart, sakta extrahera sondmatning.
- Placera djuret tillbaka i en annan bur tills alla djur från en bur är klar.
2) immunfärgning Förfaranden
- Efter behandling, möss är bedövas med hjälp av Ketamin 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg ip och intracardially perfusion med 4% Paraformaldehyd i PBS.
- Modet sedan extraheras genom dissektion, och placeras i 15% sackaros natten. Nästa dag är den vävnad överförs till 30% sackaros och inkuberas igen över natten vid 4 ° C.
- Vävnaden placeras sedan i Tissue-tek och lagras i en -80 ° C frys fram till användning.
- Med hjälp av en kryostat, 20 micron tarmen tvärsnitt över till SuperFrost bilder.
- Blockera och immunfärgning förfaranden med hjälp av anti-βIII-tubulin och anti-alfa-synuklein antikroppar skall sedan genomföras som tidigare beskrivits 9.
3) Alfa-synuklein integration bildanalys
Det rekommenderas att en extern person omedvetna om bilder "ursprung utför analysen. Därför bör uppgifterna kodifieras. Bildanalys utfördes med hjälp av FIJI programvara.
- Öppna den konfokala bildfilen. Sedan dela upp kanalerna så att det är möjligt att arbeta på varje kanal separat.
- Stäng de kanaler som inte kommer att använda och välj Analysera> Ställ Skala och ange Pixel storlek till 1. Ställ in kända avståndet till 0,13 (detta beror på målet och den uppdelning som används) och klicka på globala. Storleken på bilden kommer nu att visas i mikron.
- Välj alfa-synuklein kanal och väljer ganglion, se till att urvalet omsluter ganglion i alla skivor.
- Tryck Bild> Duplicera för att duplicera bilden. Med ganglion valt storleken på ganglion bara en bild kommer att dubbleras.
- Tryck på Redigera> Rensa Outside. Den del av bilden utanför det markerade området kommer att bli svart.
- Duplicera bilden igen för att avgöra i senare steg hur väl proceduren gick. Bilder som har ett högt signal till brus i bakgrunden förhållande bör inte användas för bildanalys.
- Välj Bild> Justera> Tröskel och välj sedan MaxEntropy. Flytta sedan över skivorna i den beskurna bilden och den ursprungliga en att se till att förfarandet gick bra. Den entropiska tröskeln väljer en nivå intensitet signal baserad på bilden histogrammet och endast de pixlar med intensitet högre än denna tröskel kommer att visas i en vit än svart bild.
- Välj Process och klicka på släta. Detta steg förvandlar pixeled kanterna på bilderna i jämna kanter.
- Välj Process, klicka sedan på Binär och välj Gör Binary. Bilden visas som en svart över vit bild.
- Duplicera bilden för att utföra nästa steg på den duplicerade bilden.
- Klicka på Analyze> Analysera partiklar. Välj sedan Visa: Riktlinjer och klicka på Sammanfatta. Resten av inställningarna bör blad i standard. Denna funktion känner igen det totala antalet pixlar med en signal och de som är grupperade tillsammans. Den totala ytan av pixlar med signal plus antalet grupper av pixlar och den genomsnittliga storleken redovisas.
- Jämföra och välja den största delen som anpassar väl. Segmentet kommer att märkas.
- Kopiera data bordet med den totala alfa-synuklein yta, antal inneslutningar och medelvärdet partikelstorlek. Klistra in informationen i ett Excel-ark eller kommenterat någon annanstans.
- Återgå till Fiji och hitta den tidigare valda segment i β-tubulin kanalen och välj den.
- Välj ganglion område och klicka på Analysera och välj sedan Mät. Annan tabell visas som visartotala ytan på ganglion.
- Extrahera data från tabellen till Excel-arket nära alfa-synuklein mätning eller kopiera ner det någon annanstans.
- Använda Excel, delar in de olika parametrarna, som erhölls i alfa-synuklein mätning av ganglion ytan för att få total alfa-synuklein yta och integration antal normaliserade av ganglion storlek.
4) representativa resultat
När sondmatning administration protokoll utförs korrekt olägenheter för djuret är minimala. Behandling med denna koncentration av rotenon möjliggör en lokal effekt av rotenon på ENS utan rotenon i blodet och ingen hämning av muskler eller hjärna mitokondrie Complex jag även efter 1,5 månaders behandling (se figur 1). Om bildanalys utförs på rätt sätt en noggrann analys av alfa-synuklein mönster bör vara möjligt. Det ger tillförlitliga uppgifter om den totala mängden alfa-synuklein (total yta), alfa-synuklein mönster i cellen (antal inneslutningar) och förekomsten av alfa-synuklein inneslutningar (inkludering storlek) (Figur 2).
Figur 1. Motor dysfunktion i rotenon behandlade möss utan upptäckt av rotenon i blod eller CNS. A, standard (50 ng / ml) och kromatogram från hjärnan prover på 20, 10 och 5 behandlas mg / kg möss. B och C, kvantifiering av rotenon i blodet (B) och CNS (C). B, blodet 1 , 2 och 3 timmar efter behandlingen. Möss delades i tre grupper (n = 3) och behandlas med 2,5, 5, 10 och 20 mg / kg rotenon (n = 3), 300 mikroliter blod utvinns 1, 2 och 3 timmar efter rotenon administration och sammanförs för HPLC-analys. C, möss behandlades för en vecka en gång om dagen med 5 (n = 3), 10 (n = 3) och 20 (n = 1) mg / kg rotenon, hjärnan och hjärnstammen utvanns 1 och 2 timmar efter sista administreringen och förberedde för HPLC-analys. D, mitokondrie Complex I aktivitet i muskler och hjärna prover av 1,5 månad behandlade möss.
Figur 2. Lokalt administrerat rotenon inducerar alfa-synuklein fosforylering, ackumulering och aggregering med gliosis i ENS ganglierna. (Skala staplar 20 mikrometer). A, B, C, anti βIII-tubulin, alfa-synuklein och DAPI färgning i tolvfingertarmen (B) och ileum ( A, C) sektioner. Arrow i B framkallade 1,5 månaders behandling en ökad alfa-synuklein punktuell mönster inuti enteriska nervsystemet ganglierna jämfört med 3 månader reglagen (A). Pil i C, 3 månaders behandling inducerad bildandet av större alfa-synuklein inneslutningar (ø> 6 mikrometer). D, immunofluorescens färgning med anti-alfa-synuklein, Thioflavine S och DAPI. Arrow i D, bara 3 månaders behandling möss visade aggregering av dessa större alfa-synuklein ansamlingar. E, E ", E'', kvantifiering bildanalys steg. E, immunostained exempel på bilden används i kvantifiering visar en ENS ganglion mot alfa-synuklein visar olika inneslutningar. E ", exempel på bild som erhållits efter bildanalys protokollet. E'', överlappning mellan några av de ursprungliga inneslutningar (grön) och representation som erhålls efter att ha utfört protokollet (gula linjer). FG, kvantifiering av försöket visas i AC gjordes med hjälp av automatisk segmentering och entropi-baserade metoder tröskeleffekt. Single-asterisk, P <0,05, och dubbelklicka asterisk, P <0,01. F, varje kolumn representerar den totala alfa-synuklein yta / ganglion yta. G, varje kolumn representerar totala antalet alfa-synuklein inneslutningar / ganglion yta. Alla Diagrammen visar medelvärde ± SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intragastriskt förvaltningen har tidigare genomförts 12. Men enligt Inden manuskript var rotenon administrerades löst i 0,5% karboxymetylcellulosa natriumsalt (CMSS) ensam. Rotenon är en hög liphophylic ämne. Därför kan rotenon inte lösas i 0,5% CMSS ensam och kommer fällningar om det gjort det. Användningen av kloroform skapar en jämnt fördelad rotenon fjädring undvika nederbörd. Dessutom, på grund av högre koncentrationer av bekämpningsmedel i CMSS, är den slutliga volymen av administrerad lösning också minskat avsevärt. Så sätt minska komplikationer i administrationen.
Vi rekommenderar användning av raka gavages. Matstrupen av musen är rak och att avsluta direkt på ena sidan av magen. Därför raka gavages är mer lämplig för denna uppgift.
Bildanalys av konfokala bilder gjordes med hjälp FIJI programvara. Den plug-ins för den här programvaran kan laddas ner på nätet. Den immunofluorescerande färgning för bildanalys gjordes som tidigare beskrivits 9. Bilderna har förvärvats med hjälp av en LSM 510 Zeiss konfokalmikroskop. Det är viktigt att bilderna förvärvats med hjälp av samma signal / brusförhållande. Detta kan åstadkommas genom att justera förstärkning och offset innan förvärvet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Francisco Pan-Montojo har en patentansökan väntan för denna djurmodell (Ansökningsnummer PCT / EP 2009/005688).
Acknowledgments
De Pedro Barrie de la Maza stiftelsen stött detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Germany |
| Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Germany |
| Carboxymethylcellulose | Sigma-Aldrich | C5678 | Germany |
| Gavage 1,2 mm x 60 mm | Unimed | Switzerland | |
| LSM 510 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FIJI | http://pacific.mpi-cbg.de |
References
- Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).
- Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system. Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).
- Wakabayashi, K. Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism. J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).
- Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons. Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).
- Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).
- Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living. Neurology. 50, 1346-1350 (1998).
- Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals. Neurology. 42, 1328-1335 (1992).
- Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease. Neurology. 43, 1150-1158 (1993).
- Pan-Montojo, F. Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice. PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).
- Sherer, T. B. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).
- Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. Toxin-induced models of Parkinson's disease. NeuroRx. 2, 484-494 (2005).
- Inden, M. Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone. J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).
