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Neuroscience

Rotenone के मौखिक प्रशासन आंत्र तंत्रिका तंत्र में एक Gavage और अल्फा synuclein Inclusions की छवि विश्लेषण का उपयोग

doi: 10.3791/2123 Published: October 26, 2010

Summary

पार्किंसंस रोग कीटनाशकों के संपर्क करने के लिए संबंधित दिया गया है. यहाँ हम एक विधि वांछित एकाग्रता और एक अल्फा synuclein संचय में आंतों का तंत्रिका तंत्र में उनके प्रभाव का विश्लेषण विधि में एक गैस्ट्रिक ट्यूब का उपयोग कीटनाशकों देने दिखाओ.

Abstract

पार्किंसंस रोग रोगियों (पीडी), जुड़े विकृति एक विशेषता पैटर्न शामिल अंतर अन्य बातों के साथ आंतों का तंत्रिका तंत्र 1,2 (ENS), घ्राण बल्ब (ओ), वेगस 3 (DMV) के पृष्ठीय मोटर नाभिक, intermediolateral के बाद रीढ़ की हड्डी में 4 और substantia nigra के नाभिक, 4,5 रोग के neuropathological मंचन के लिए आधार प्रदान करते हैं. ENS और ओबी सबसे उजागर तंत्रिका संरचनाओं और पहले प्रभावित होने वाले हैं. दिलचस्प है, पीडी कीटनाशक 6-8 जोखिम के लिए संबंधित दिया गया है . यहाँ हम विस्तार में दो हमारे पिछले अध्ययन में 9 तरीकों का इस्तेमाल किया दिखाते हैं. आदेश में rotenone ENS पर स्थानीय रूप से अभिनय के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, हम एक वर्षीय C57/BL6 चूहों को एक gavage का उपयोग कर rotenone दिलाई. Rotenone एक व्यापक रूप से इस्तेमाल कीटनाशक है कि जोरदार mitochondrial परिसर 10 मैं रोकता है . यह अत्यधिक lipophylic और खराब जठरांत्र पथ में 11 अवशोषित है. हमारे नतीजे बताते हैं कि 5 मिलीग्राम / किलो rotenone के प्रशासन mitochondrial परिसर मैं मांसपेशियों या मस्तिष्क में गतिविधि को बाधित नहीं किया. सुझाव इस प्रकार, कि हमारे प्रशासन विधि rotenone का उपयोग hepatoportal प्रणाली को पार नहीं किया था और ENS पर पूरी तरह अभिनय. यहाँ हम कीटनाशकों का उपयोग कर एक gavage और छवि विश्लेषण ENS में अल्फा synuclein संचय में कीटनाशक के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल प्रशासन विधि दिखा. पहला हिस्सा एक तरीका है कि एक वांछित सटीक एकाग्रता में कीटनाशकों (rotenone) की intragastric प्रशासन की अनुमति देता है दिखाता है. दूसरी विधि अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण के एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ENS में अल्फा synuclein संचय विश्लेषण प्रोटोकॉल से पता चलता है.

Protocol

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1) Rotenone की intragastric प्रशासन

  1. पशु वजन.
  2. / Rotenone वाहन की जरूरत समाधान की कुल मात्रा की गणना. इस मामले में जानवरों के वजन के प्रति ग्राम 0.01 मिलीग्राम.
  3. Rotenone समाधान के पहले गणना की मात्रा (0.625 मिलीग्राम / एमएल rotenone, 4% carboxymethylcellulose और 1.25% क्लोरोफॉर्म) या वाहन समाधान (में 4% carboxymethylcellulose और 1.25% क्लोरोफॉर्म) के साथ एक 1 एमएल सिरिंज प्रभार. इस मामले में यह एक 5 rotenone मिलीग्राम / किग्रा खुराक से मेल खाती है है.
  4. माउस उठाओ और एक हाथ से माउस पूंछ पकड़, दूसरे हाथ की पहली दो उंगलियों के साथ खींच द्वारा गर्दन की त्वचा खिंचाव.
  5. एक बार सिर दो उंगलियों के बीच तय हो गई है, यह हाथ की हथेली के खिलाफ दुबला और यह ऊपर से नीचे बारी. चौथे और पांचवें पूंछ का उपयोग कर उंगलियों को ठीक.
  6. पीछे की ओर सिर रखते हुए, तालू प्रेस करने के लिए माउस मुँह खुला. धीरे मुँह में gavage परिचय. यह एक gavage और एक नियमित सुई सुई का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. धीरे धीरे, पेट की दिशा में अभी तक पर्याप्त gavage चाल है. इस सामग्री से बचने के फेफड़ों में हो रही है.
  7. धीरे embolus दबाकर rotenone समाधान या वाहन प्रशासन. जब पूरा हो, धीरे धीरे gavage निकाल सकते हैं.
  8. दूसरे पिंजरे में वापस जानवर रखें जब तक एक पिंजरे से सभी जानवरों किया जाता है.

2) Immunostaining प्रक्रिया

  1. उपचार के बाद, चूहों anesthetized हैं Ketamin 100 मिलीग्राम / किग्रा und Xylazin 10 मिलीग्राम / किग्रा आईपी और intracardially पीबीएस में 4% Paraformaldehyde के साथ perfused का उपयोग.
  2. हिम्मत तो विच्छेदन द्वारा निकाले जाते हैं, और 15% sucrose में रात भर रखा. अगले दिन, ऊतक 30% sucrose के लिए स्थानांतरित कर रहा है और फिर 4 पर रातोंरात incubated डिग्री सेल्सियस
  3. ऊतक तो ऊतक-टेक में रखा गया है और उपयोग करें जब तक एक -80 ° सी फ्रीजर में संग्रहीत.
  4. एक cryostat का प्रयोग, 20 माइक्रोन आंत पार वर्गों Superfrost स्लाइड्स को हस्तांतरित कर रहे हैं.
  5. अवरुद्ध और विरोधी βIII ट्यूबिलिन और विरोधी अल्फा synuclein एंटीबॉडी का उपयोग प्रक्रियाओं immunostaining तो 9 पहले से वर्णित के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं.

3) अल्फा synuclein समावेशन छवि विश्लेषण

यह अनुशंसा की जाती है कि एक बाहरी छवियों मूल से अनजान व्यक्ति विश्लेषण करता है. इसलिए, डेटा संहिताबद्ध किया जाना चाहिए. छवि विश्लेषण फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया था.

  1. Confocal छवि फ़ाइल खोलें. फिर, चैनल विभाजन इतना है कि यह संभव है हर चैनल पर स्वतंत्र रूप से काम.
  2. उन चैनलों कि उपयोग करने के लिए हो सकता है और विश्लेषण> स्केल सेट और 1 के लिए पिक्सेल आकार सेट का चयन नहीं जा रहे हैं बंद करो. 0.13 (इस उद्देश्य और संकल्प इस्तेमाल किया पर निर्भर करेगा) के लिए जाना जाता दूरी सेट और वैश्विक पर क्लिक करें. छवि का आकार अब microns में दिखाया जाएगा.
  3. अल्फा synuclein चैनल चुनें और नाड़ीग्रन्थि का चयन करें, सुनिश्चित करें कि चयन सभी स्लाइस में नाड़ीग्रन्थि encloses.
  4. प्रेस छवि> छवि डुप्लिकेट डुप्लिकेट. नाड़ीग्रन्थि चयनित के साथ, केवल एक छवि नाड़ीग्रन्थि के आकार दोहराया जाएगा.
  5. प्रेस> साफ बाहर संपादित करें. चयनित क्षेत्र के बाहर छवि का हिस्सा काला हो जाएगा.
  6. फिर छवि को कितनी अच्छी तरह प्रक्रिया चला गया बाद के चरणों में निर्धारित डुप्लिकेट. छवियाँ है कि एक उच्च अनुपात करने के लिए पृष्ठभूमि शोर संकेत है छवि विश्लेषण के लिए नहीं किया जाना चाहिए.
  7. छवि> समायोजित> थ्रेसहोल्ड का चयन करें, और तब MaxEntropy चयन करें. फिर फसली छवि और मूल एक स्लाइस पर स्थानांतरित करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया अच्छी तरह से चला गया. entropic सीमा एक तीव्रता संकेत छवि हिस्टोग्राम और इस सीमा से अधिक तीव्रता काले छवि पर एक सफेद में प्रदर्शित किया जाएगा के साथ ही उन पिक्सल के आधार पर स्तर का चयन करता है.
  8. प्रक्रिया का चयन करें, तो चिकना पर क्लिक करें. यह कदम चिकनी किनारों में छवियों के किनारों pixeled बदल देती है.
  9. प्रक्रिया का चयन करें, तो द्विआधारी पर क्लिक करें, और बाइनरी बनाओ चुनें. छवि सफेद छवि पर एक काले रंग की के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा.
  10. छवि डुप्लिकेट दोहराया छवि पर अगले कदम प्रदर्शन.
  11. विश्लेषण> विश्लेषण के कणों पर क्लिक करें. तब दिखाएँ का चयन करें: रूपरेखा और सारांश पर क्लिक करें. डिफ़ॉल्ट में सेटिंग्स के बाकी त्यागा होना चाहिए. इस समारोह में एक संकेत है और उन है कि एक साथ समूहीकृत कर रहे हैं के साथ पिक्सल की कुल संख्या को पहचानता है. संकेत अधिक पिक्सल के समूहों की संख्या और मतलब आकार के साथ पिक्सल की कुल सतह रिपोर्ट कर रहे हैं.
  12. तुलना करें और सबसे बड़ा टुकड़ा है कि अच्छी तरह से समायोजित कर देता है का चयन करें. टुकड़ा चिह्नित किया जाएगा.
  13. कुल सतह अल्फा synuclein, inclusions की संख्या और मतलब कण आकार के साथ डेटा तालिका की प्रतिलिपि बनाएँ. एक एक्सेल स्प्रेडशीट या कहीं और एनोटेट में डेटा चिपकाएँ.
  14. फिजी पर लौटें और β-ट्यूबिलिन चैनल में पहले से चयनित टुकड़ा मिल जाए, और उसका चयन करें.
  15. नाड़ीग्रन्थि क्षेत्र का चयन करें और पर क्लिक करें तो उपाय का चयन विश्लेषण. किसी अन्य तालिका दिखा दिखाई देगानाड़ीग्रन्थि की कुल सतह.
  16. तालिका से डेटा या अल्फा synuclein माप के निकट एक्सेल शीट निकालें इसे कॉपी नीचे कहीं.
  17. Excel का उपयोग कर, अलग नाड़ीग्रन्थि सतह से अल्फा synuclein माप में प्राप्त कुल अल्फा synuclein सतह और शामिल किए जाने नाड़ीग्रन्थि आकार के द्वारा सामान्यीकृत संख्या प्राप्त करने के मापदंडों को विभाजित.

4) प्रतिनिधि परिणाम

जब gavage प्रशासन प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है पशुओं के लिए असुविधाओं कम कर रहे हैं. Rotenone के इस एकाग्रता का उपयोग कर उपचार रक्त में rotenone स्तर के बिना ENS पर rotenone के स्थानीय प्रभाव के लिए सक्षम बनाता है और मांसपेशियों या मस्तिष्क mitochondrial परिसर का कोई अवरोध मैं भी उपचार के 1.5 महीने (चित्रा 1 देखें) के बाद. यदि छवि विश्लेषण सही ढंग से किया जाता है अल्फा synuclein पैटर्न के एक कठोर विश्लेषण संभव होना चाहिए. यह अल्फा synuclein (कुल सतह), अल्फा synuclein कक्ष में पैटर्न (inclusions की संख्या) और अल्फा synuclein inclusions की उपस्थिति (शामिल किए जाने का आकार) (चित्रा 2) की कुल राशि पर विश्वसनीय आंकड़े देता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Rotenone में मोटर शिथिलता सीएनएस में रक्त या rotenone का पता लगाने के के बिना चूहों का इलाज किया . एक, मानक (50 एनजी / एमएल) और 20, 10 और 5 मिलीग्राम / किग्रा इलाज चूहों के मस्तिष्क के नमूने से chromatogram. बी और सी, रक्त में rotenone स्तर (बी) और CNS (सी) की मात्रा का ठहराव बी., रक्त स्तर 1 इलाज के बाद 2 और 3 घंटे. चूहे को तीन समूहों (n = 3) में विभाजित किया गया और 2.5, 5, 10, और 20 मिलीग्राम / किग्रा rotenone के साथ इलाज किया (n = 3), रक्त की 300 μL rotenone प्रशासन के बाद 1, 2 और 3 घंटे निकाला गया था और के लिए एक साथ जमा HPLC विश्लेषण सी, चूहों को एक सप्ताह के लिए इलाज किया गया एक बार (n = 1) 5 (n = 3), 10 (n = 3) और 20 के साथ एक दिन मिलीग्राम / किग्रा rotenone मस्तिष्क, और brainstem 1 निकाले गए थे और 2 घंटे के बाद पिछले प्रशासन और HPLC विश्लेषण डी, mitochondrial परिसर मैं 1.5 महीने इलाज चूहों की मांसपेशियों और मस्तिष्क के नमूने में गतिविधि के लिए तैयार है.

चित्रा 2
चित्रा 2. स्थानीय प्रशासित rotenone ENS ganglia में gliosis साथ लाती अल्फा synuclein phosphorylation संचय, और एकत्रीकरण (पैमाने सलाखों सुक्ष्ममापी 20). ए, बी, सी, (βIII ट्यूबिलिन, अल्फा synuclein और ग्रहणी में DAPI धुंधला (बी) विरोधी और ileum ए, सी) वर्गों. बी में तीर, 1.5 महीने के उपचार एक बढ़ा अल्फा synuclein आंतों का तंत्रिका तंत्र के ganglia अंदर कबरा पैटर्न प्रेरित जब 3 महीने नियंत्रण (ए) की तुलना में. सी में तीर, बड़ा अल्फा synuclein inclusions (Ø सुक्ष्ममापी> 6) के 3 महीने के उपचार के गठन प्रेरित विकास, immunofluorescence विरोधी अल्फा synuclein, Thioflavine एस और DAPI का उपयोग कर धुंधला हो जाना. डी में तीर, केवल 3 महीने इलाज चूहों इन बड़े अल्फा synuclein राशि के एकत्रीकरण से पता चला है ई, ई, ई'', छवि विश्लेषण मात्रा का ठहराव कदम. ई, उदाहरण के एक ENS नाड़ीग्रन्थि दिखा मात्रा का ठहराव में इस्तेमाल किया छवि के अल्फा synuclein के खिलाफ immunostained दिखा अलग 'ई inclusions, छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त की छवि के उदाहरण ई.'', कुछ मूल (हरा) inclusions और प्रोटोकॉल (पीला लाइनों) के प्रदर्शन के बाद प्राप्त प्रतिनिधित्व के बीच ओवरलैप. FG, प्रयोग में दिखाया गया है की मात्रा का ठहराव एसी स्वचालित विभाजन और एन्ट्रापी आधारित thresholding तरीकों का उपयोग कर बनाया गया था. एकल तारांकन, पी <0.05, और डबल तारांकन, पी 0.01 <एफ, प्रत्येक स्तंभ के कुल अल्फा synuclein / सतह नाड़ीग्रन्थि सतह का प्रतिनिधित्व करता है जी. प्रत्येक स्तंभ अल्फा synuclein inclusions / नाड़ीग्रन्थि सतह की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करता है. सभी रेखांकन दिखाने ± sem मतलब

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Discussion

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Intragastric प्रशासन पहले 12 प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, Inden पांडुलिपि के अनुसार, rotenone प्रशासित 0.5% carboxymethylcellulose सोडियम नमक (CMSS) अकेले में भंग किया गया था. Rotenone एक उच्च liphophylic पदार्थ है. इसलिए, rotenone 0.5% CMSS में अकेले भंग नहीं कर सकते हैं और अगर ऐसा किया वेग होगा. क्लोरोफॉर्म का उपयोग एक समान रूप से वितरित rotenone वर्षा से बचने के निलंबन बनाता है. इसके अलावा, CMSS में कीटनाशक के उच्च सांद्रता के कारण प्रशासित समाधान के अंतिम मात्रा भी काफी कमी आई है. इस प्रकार, प्रशासन में जटिलताओं को कम करने.

हम सीधे gavages का उपयोग की सलाह देते हैं. माउस के घुटकी है, सीधे सीधे पेट के एक पक्ष पर समाप्त. इसलिए, सीधे gavages इस कार्य के लिए पर्याप्त हैं.

Confocal छवियों की छवि विश्लेषण फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था. इस सॉफ्टवेयर के लिए प्लग - इन्स ऑनलाइन डाउनलोड किया जा सकता है. छवि विश्लेषण के लिए immunofluorescent धुंधला 9 पहले से वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था. छवियाँ LSM 510 Zeiss confocal खुर्दबीन का उपयोग कर हासिल किया गया. यह महत्वपूर्ण है कि छवियों को एक ही संकेत / शोर अनुपात का उपयोग अर्जित कर रहे हैं. इस लाभ का समायोजन करके प्राप्त किया जा सकता है और अधिग्रहण से पहले ऑफसेट.

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Disclosures

पान Montojo फ्रांसिस्को इस पशु मॉडल (अनुप्रयोग संख्या पीसीटी / EP 2009/005688) के लिए एक पेटेंट आवेदन लंबित है.

Acknowledgments

पेड्रो Barrie डे ला Maza फाउंडेशन ने इस काम का समर्थन किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Germany
Chloroform Carl Roth GmbH 3313.1 Germany
Carboxymethylcellulose Sigma-Aldrich C5678 Germany
Gavage 1,2 mm x 60 mm Unimed Switzerland
LSM 510 Carl Zeiss, Inc.
FIJI http://pacific.mpi-cbg.de

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References

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Pan-Montojo, F. J., Funk, R. H. Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System. J. Vis. Exp. (44), e2123, doi:10.3791/2123 (2010).More

Pan-Montojo, F. J., Funk, R. H. Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System. J. Vis. Exp. (44), e2123, doi:10.3791/2123 (2010).

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