Summary
Parkinson hastalığı, pestisitlere maruz kalma ile ilgili olmuştur. Burada bir gastrik tüp istenen konsantrasyon ve enterik sinir sistemi alfa-sinüklein birikimi etkilerini analiz etmek için bir yöntem kullanarak pestisitler sağlamak için bir yöntem gösteriyor.
Abstract
Parkinson hastalığında (PH) olan hastalarda, ilgili patoloji, diğerlerinin yanı sıra enterik sinir sistemi (ENS) 1,2, koku ampul (OB), vagus (DMV) 3 dorsal motor çekirdeği, intermediolateral içeren bir karakteristik bir yol izler omurilik 4 ve substantia nigra çekirdeği, hastalığın 4,5 nöropatolojik evreleme için bir temel sağlamaktadır. ENS ve OB en çok maruz kalan sinir yapıları ve ilk etkilenecek olanlar. İlginçtir, PD pestisit maruziyetinin 6-8 ile ilgili olmuştur. Burada ayrıntılı olarak, önceki çalışmada 9 kullanılan iki yöntem gösteriyor . ENS üzerinde yerel olarak hareket rotenone etkilerini analiz etmek için, biz, bir yıl eski C57/BL6 fareler bir sonda kullanarak rotenone yönetilmektedir. Rotenone güçlü mitokondriyal Kompleksi Ben 10 inhibe yaygın olarak kullanılan pestisit. Bu yüksek lipofilik ve kötü gastrointestinal sistem 11 emilir. Bizim sonuçlarımız, 5 mg / rotenone kg yönetimi mitokondriyal Kompleksi kas veya beyin aktivitesi inhibe etmediğini gösterdi. Böylece, bizim yönetim yöntemi rotenone kullanarak hepatoportal sistemi çapraz vermedi ve sadece ENS üzerinde hareket ediyordu düşündüren. Burada pestisitler ENS alfa-sinüklein birikimi pestisit etkilerini analiz etmek için kullanılan bir sonda ve görüntü analizi protokolü kullanarak yönetmek için bir yöntem. Ilk bölümünde istenen hassas konsantrasyonda pestisitler (rotenone) intragastrik yönetimi sağlayan bir yöntem gösterir. İkinci yöntem, bir görüntü analiz yazılımı kullanarak ENS alfa-sinüklein birikimi analiz etmek için bir yarı-otomatik görüntü analiz protokolünü gösterir.
Protocol
1) Rotenone intragastrik İdaresi
- Hayvan tartılır.
- Gerekli rotenone / araç çözüm toplam hacmi hesaplayın. Bu durumda hayvan ağırlığı gram başına 0,01 ml.
- Önceden hesaplanmış rotenone çözüm hacmi (0.625 mg / ml rotenone,% 4 karboksimetilselüloz ve% 1.25 kloroform) veya araç çözüm (% 4 karboksimetilselüloz ve kloroform% 1.25) ile 1 ml şırınga şarj edin. Bu durumda, bir 5 mg / kg rotenone doz karşılık gelir.
- Öte yandan ilk iki parmakları ile çekerek fare Pick up ve fare kuyruğu, tek elle tutarak, boyun cildi germek.
- Başı iki parmak arasında sabit bir kez, elin avuç içi karşı yalın ve baş aşağı çevirin. Dördüncü ve beşinci parmakları kullanarak kuyruk sabitleyin.
- Baş arkaya doğru tutmak, damak farenin ağzına açmak için tuşuna basın. Yavaşça ağzına gavaj tanıtmak. Sonda bir iğne ve düzenli bir iğne kullanmak önemlidir. Yavaş yavaş, yeteri kadar mide yönde sonda taşımak. Bu akciğerlerin elde malzeme önlemek olacaktır.
- Emboli hafifçe basarak rotenone çözüm veya araç yönetin. Tamamlandığında, yavaş yavaş gavaj ayıklayın.
- Bütün hayvanlar bir kafes yapılır kadar başka bir kafeste hayvan geri yerleştirin.
2) immün Prosedürleri
- Tedaviden sonra, fare Ketamin 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg ip ve intrakardiyak PBS içinde% 4 Paraformaldehit ile perfüze kullanarak anestezi.
- Cesaret sonra diseksiyon tarafından çıkarılan ve bir gecede% 15 sakaroz yerleştirilir. Ertesi gün, doku% 30 sakaroz aktarılır ve 4 gecede tekrar inkübe ° C
- Daha sonra doku Doku tek yerleştirilir ve kullanana kadar -80 ° C derin dondurucuda saklanır.
- Bir Kriyostat kullanarak, 20 mikron bağırsak kesitleri SuperFrost slaytlar aktarılır.
- Anti-βIII-tubulin ve anti-alfa-sinüklein antikorları kullanarak prosedürleri Engelleme ve immün sonra daha önce açıklanan 9 olarak yapılmaktadır.
3) Alfa-sinüklein İçerme Görüntü Analizi
Bu görüntüleri 'kökenli habersiz harici bir kişi analizi gerçekleştiren tavsiye edilir. Bu nedenle, veri kodlanmış olmalıdır. Görüntü analizi Fiji yazılımı kullanılarak yapıldı.
- Konfokal görüntü dosyasını açın. Daha sonra, bu her kanal bağımsız çalışmak mümkün olduğunu kanalları ayrıldı.
- Bu kanalların kullanımı ve Analiz> Ölçek ayarlama ve 1 Piksel boyutu ayarlamak seçmek için gidiş değildir kapatın. 0,13 (bu amacı ve kullanılan çözünürlük bağlıdır) olarak bilinen mesafeyi ayarlayın ve küresel tıklayın. Görüntünün boyutu artık mikron gösterilir.
- Alfa-sinüklein kanalı seçin ve ganglion seçin, seçimi tüm dilimleri ganglion kapsadığından emin olun.
- Basın Image> görüntü çoğaltmak için çoğaltın. Ganglion seçildiğinde, sadece bir görüntü boyutu ganglion yinelenir.
- Basın Düzenle> Temizle dışında. Seçilen bölge dışından görüntü parçası siyah olacak.
- Prosedürü ne kadar iyi gitti sonraki adımları belirlemek için görüntüyü yeniden çoğaltın. Gürültü arka plan oranı yüksek bir sinyal Görüntüler görüntü analizi için kullanılan olmamalıdır.
- Image> Adjust> Threshold seçin ve sonra MaxEntropy seçin. Sonra prosedürü iyi gittiğini sağlamak için kırpılmış resim ve özgün bir dilimleri üzerinde taşıyın. Entropik eşik görüntü histogram ve bu eşiğin daha yüksek şiddetlerde siyah resmin üzerine beyaz görünecektir, yalnızca piksel dayalı bir yoğunluk sinyal seviyesi seçer.
- Süreç seçin, ardından Pürüzsüz tıklayın. Bu adım pixeled kenarları düzgün kenarlara görüntüleri dönüştürür.
- Süreç seçin, sonra İkili tıklatın ve İkili olun seçin. Görüntü üzerine siyah beyaz görüntü olarak görünecektir.
- Çoğaltılmış görüntü sonraki adımı gerçekleştirmek için görüntü çoğaltın.
- Analiz> analiz parçacıklar üzerine tıklayın. Sonra Göster'i seçin: Anahatları ve özetleyin tıklayın. Varsayılan ayarları geri kalanı yapraklı olmalıdır. Bu fonksiyon, bir sinyal ve birlikte gruplandırılır toplam piksel sayısı tanır. Sinyal artı piksel gruplarının sayısı ve ortalama büyüklüğü piksel toplam yüzey rapor edilmiştir.
- Karşılaştırın ve iyi ayarlayan büyük dilim seçin. Dilim işaretlenir.
- Toplam alfa-sinüklein yüzey kapanımlar sayısı ve ortalama partikül boyutu ile veri tablosu kopyalayın. Verileri bir excel tablo ya da başka bir yerde açıklamalı içine yapıştırın.
- Fiji dönün ve β-tubulin kanal önceden seçilmiş bir dilim bulmak ve seçmek.
- Ganglion alanı seçin ve sonra ölçün seçin analiz. Başka bir tablo gösteren görünecektirganglion toplam yüzey.
- Alfa-sinüklein ölçüm yakın excel sayfasına tablodan veri ayıklamak ya da başka bir yere kopyalayın.
- Excel kullanarak, alfa-sinüklein ölçüm ganglion boyutuna göre normalize toplam alfa-sinüklein yüzey ve içerme numarası ganglion yüzey elde etmek için elde edilen farklı parametreler bölün.
4) Temsilcisi Sonuçlar
Gavaj yönetim protokolü doğru yapıldığında sakıncaya hayvan için en az düzeydedir. Tedavi rotenone bu konsantrasyonu kullanılarak kan rotenone düzeyleri olmadan ENS üzerinde rotenone yerel bir etkisi sağlar ve kas veya beyin mitokondriyal Kompleksi inhibisyonu ben bile tedavi 1.5 ay sonra (bkz. Şekil 1). Görüntü analiz doğru yapılmazsa, alfa-sinüklein desen titiz bir analiz mümkün olmalıdır. Alfa-sinüklein (toplam yüzey), alfa-sinüklein hücre deseni (inklüzyon sayısı) ve alfa-sinüklein inklüzyon varlığı (dahil boyutu) (Şekil 2) toplam tutarı hakkında güvenilir veriler verir.
Şekil 1. Rotenone Motor fonksiyon bozukluğu, kan ya da MSS rotenone algılama olmadan fareler davrandı. A, standart (50 ng / ml) ve 20, 10 ve 5 mg / kg tedavi edilen farelerin beyin örnekleri kromatogram B ve C, ölçümü, rotenone kan düzeyleri (B) ve MSS (C) B, kan seviyeleri 1 , tedaviden sonra 2 ve 3 saat. Fareler üç grup (n = 3) bölünmüş ve 2.5, 5, 10 ve 20 mg / kg rotenone ile tedavi edildi (n = 3), 300 mcL kan rotenone uygulamadan sonra 1, 2 ve 3 saat ayıklanır ve bir araya toplanmış oldu HPLC analizi ile günde 5 (n = 3), 10 (n = 3) ve 20 mg / kg (n = 1) rotenone, beyin ve beyin sapı 2 saat sonra 1 çıkarılan ve bir kez C, fareler bir hafta süreyle tedavi edildi son yönetim ve HPLC analizi D, mitokondriyal Kompleksi 1,5 ay tedavi edilen farelerde kas ve beyin örnekleri faaliyet için hazır.
Şekil 2. Yerel idare rotenone ENS ganglionlarda gliozis ile alfa-sinüklein fosforilasyon, birikim ve toplama indükler (20 mikron ölçekli barlar). A, B, C, anti βIII-tubulin, alfa-sinüklein ve onikiparmak bağırsağı DAPI boyama (B) ve ileum ( A, C) bölümleri. 3 ay kontrolleri (A) kıyasla B Ok, 1.5 ay tedavi, enterik sinir sistemi ganglionlar içinde artan bir alfa-sinüklein noktalı desen kaynaklı . C Ok, büyük alfa-sinüklein kapanımlar (Ø> 6 mm) 3 ay tedavi indüklenen oluşumu D anti-alfa-sinüklein, Thioflavine G ve DAPI kullanarak immünofloresan boyama. D Ok, tedavi edilen farelerin sadece 3 ay bu büyük alfa-sinüklein birikimleri agregasyon gösterdi. D, E, D'', görüntü analiz kantifikasyon adımları, E, bir ENS ganglion gösteren nicellendirmesinde kullanılan görüntü örnek gösteren alfa sinüklein karşı immunohistokimyasal farklı kapanımlar E ', görüntü analiz protokolü sonra elde edilen görüntü örneği E'', bazı orijinal kapanımlar (yeşil) ve protokolü (sarı hat) gerçekleştirdikten sonra elde edilen temsili arasındaki örtüşme. FG, gösterilen deney ölçümü AC otomatik segmentasyon ve entropi tabanlı eşikleme yöntemleri kullanılarak yapıldı. Tek yıldız, p <0.05, ve çift-yıldız, p <0.01 F, her sütun toplam alfa-sinüklein yüzey / ganglion yüzey temsil G, her sütun, alfa-sinüklein kapanımlar / ganglion yüzey toplam sayısını temsil eder . Tüm grafikler ortalama ± sem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intragastrik yönetiminin daha önce 12 yapılmıştır . Ancak,% 0.5 karboksimetilselüloz sodyum tuzu (CMSS) tek başına Inden Kullanıcı el yazmasına göre, rotenone verildi çözülmüş. Rotenone yüksek bir liphophylic madde. Bu nedenle, rotenone yalnız% 0.5 CMSS içinde çözünmüş olamaz ve eğer bunu çöktürmek olacaktır. Kloroform yağış kaçınarak eşit olarak dağıtılmış bir rotenone süspansiyon oluşturur. Ayrıca, yüksek konsantrasyonlarda CMSS pestisit nedeniyle, uygulanan çözümün nihai hacmi de önemli ölçüde azalmıştır. Böylece, yönetimde komplikasyonları azaltır.
Biz düz un beşinci kullanmanızı öneririz. Fare yemek borusu, mide doğrudan bir tarafta biten, düz. Bu nedenle, düz un beşinci, bu görev için daha yeterli.
Konfokal görüntü Görüntü analizi Fiji yazılımı kullanılarak yapıldı. Bu yazılım için eklentileri indirebilirsiniz. Immunofluorescent boyama görüntü analizi için daha önce açıklanan 9 olarak yapıldı. Görüntüler LSM 510 Zeiss Konfokal Mikroskobu kullanılarak elde edildi. Görüntüleri aynı sinyal / gürültü oranı kullanılarak elde edilen önemlidir. Bu ayarlama kazanç elde ve satın alma öncesi mahsup edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Francisco Pan-Montojo bu hayvan modeli (Application sayısı PCT / EP 2009/005688) için bekleyen bir patent başvurusu vardır.
Acknowledgments
- Pedro Barrie de la Maza Vakfı bu çalışmaları destekledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Germany |
| Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Germany |
| Carboxymethylcellulose | Sigma-Aldrich | C5678 | Germany |
| Gavage 1,2 mm x 60 mm | Unimed | Switzerland | |
| LSM 510 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FIJI | http://pacific.mpi-cbg.de |
References
- Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).
- Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system. Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).
- Wakabayashi, K. Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism. J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).
- Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons. Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).
- Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).
- Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living. Neurology. 50, 1346-1350 (1998).
- Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals. Neurology. 42, 1328-1335 (1992).
- Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease. Neurology. 43, 1150-1158 (1993).
- Pan-Montojo, F. Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice. PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).
- Sherer, T. B. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).
- Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. Toxin-induced models of Parkinson's disease. NeuroRx. 2, 484-494 (2005).
- Inden, M. Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone. J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).
