In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Summary

Orthotopic djurmodeller av äggstockscancer replikera bättre mänskliga sjukdomar och därmed öka vår förståelse av cancer progression och tumörens svar på behandling. En musmodell får en intrabursal injektion av luciferas-uttryckande celler äggstockarna tumör. Behandling ges via oral sondmatning. Tumörtillväxt övervakas av

Abstract

Cancer hos människor, liksom terapisvaret är bättre representerade i orthotopic djurmodeller. Detta dokument beskriver utvecklingen av en orthotopic musmodell av äggstockscancer, behandling av cancer via oral leverans av läkemedel och uppföljning av tumörceller reaktioner på missbruksbehandling i realtid med hjälp av in vivo imaging system. I denna orthotopic modell är äggstockarna tumörceller som uttrycker luciferas appliceras lokalt genom att injicera dem direkt i musen Bursa där varje äggstock bifogas. Vid injektion av D-luciferin, ett substrat för eldfluga luciferas, luciferas-uttryckande celler som genererar bioluminescens signaler. Denna signal detekteras av in vivo imaging-system och tillåter en icke-invasiv sätt att övervaka tumörtillväxt, distribution och inskränkningar i det enskilda djur. Drug administration via oral sondmatning tillåter en maximal dosering volym på 10 ml / kg kroppsvikt som ska levereras direkt till magen och liknar leverans av läkemedel i klinisk behandling. Därför beskrivs tekniker här, utveckling av en orthotopic musmodell av äggstockscancer, muntliga leverans av läkemedel, och in vivo-avbildning, är användbara för att bättre förstå mänsklig äggstockscancer och behandling och kommer att förbättra målinriktningen denna sjukdom.

Protocol

I. Beredning av celler äggstockarna tumör

1. Väx äggstockscancer cancercellinjer uttrycker luciferas i kultur. Källor till luciferas kan Firefly, Renilla, eller andra arter. Celler som uttrycker fluorescerande proteiner kan också användas. För denna demonstration använder vi en äggstockscancer linje cancercell, OVCAR5 och uttryckte eldfluga luciferas.
2. Harvest celler med rutin teknik cellkultur.
3. Håll cellsuspension (10.000 celler / mikroliter) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is tills tiden för injektion.

II. Intrabursal Injection

Denna procedur kräver hjälp av en andra person. Alla kirurgiska ingrepp sker under aseptiska förhållanden. Detta inkluderar att bära kirurgiska kläder och använder sterila kirurgiska instrument, sprutor och nålar.

1. Förbered anestesi lösning genom att blanda 3 ml ketamin hydroklorid (100 mg / ml), 1,6 ml xylazinhydroklorid (100 mg / ml), 1,5 ml acepromazin (10 mg / ml) och 20 ml 0,9% natriumklorid.
2. Kontrollera djurets identifikationsnummer och observerbara hälsa. Bedöva djuret med förberedda ketamin-xylazin-acepromazin anestesi via intraperitoneal (ip) injektion med en dos på 8 ~ 9 ml / kg kroppsvikt (BW).
3. Kontrollera att djuret är under en acceptabel slätt av anestesi genom att utföra en tå nypa med pincett eller fingrarna genom dess hind tassar. Om det finns pedalen reflex, vänta på ett djupare vanligt av anestesi till dess att djuret svarar på detta förfarande.
4. Lägg sidan djuret rygg upp på en steril kompress med huvudet vänd bort och svansen vänd mot dig. Poängen med snitt är placerad till vänster eller höger om mittlinjen och över äggstockarna. Raka eller våta pälsen med 70% alkohol vid snittet punkten.
5. Lyft fuktade huden med pincett och gör ett litet snitt med sax på dorsomedial position och direkt ovanför äggstockarna fett pad. Den äggstockarna fett pad ska synas under ytan av peritoneal väggen. Fett pad är lätt att känna igen med sin vita färg i kontrast till den mörka rosa vävnad som omger den.
6. Lyft försiktigt peritoneal väggbeklädnad och göra ett litet snitt enligt ovan (5).
7. Placera en steril indränkt koksaltlösning kompress på mittlinjen intill snittet. Leta reda på äggstockarna fett pad och dra ut det försiktigt och vila den på gasväv. Stabilisera äggstockarna genom att klämma fettet pad med en bulldog klipp. Enligt en dissekera mikroskop ställning i äggstockarna, för att möjliggöra införandet av nålen (30 gauge, G) i äggledare tubuli böja leder till Bursa. När nålen sätts in i rätt position bör det syns under Bursa.
8. Tryck försiktigt in kolven i sprutan för att injicera 5 mikroliter cellsuspension mellan Bursa och äggstocken när sprutan är placerad på injektionsstället. Detta steg kräver två personer. En person skjuter kolven, medan den andra personen upprätthåller positionering av nålen. Ta bort nålen snabbt att försegla punktionsstället men försiktigt nog att inte riva bursa och tubuli. Den Bursa skulle tyckas vara något utspänd med ordentlig injektion.
9. Släpp fettet pad från bulldogg klipp och försiktigt ersätta reproduktionsorganen och fett pad tillbaka in i bukhålan. Stäng försiktigt kroppen väggen genom att dra den övre peritoneal slemhinnan över det nedre fodret. Stäng huden med kirurgiska häftklamrar eller klipp sår.
10. Placera återhämtar djuret tillbaka i sin bur och ger en säker värmekälla för att undvika hypotermi och påskynda återhämtningen. Övervaka andning och lindra, återsändande av muskeltonus, och möjligheten att frivilligt flytta. Dessa är alla goda indikatorer på utvecklingen mot återhämtning. Klammer eller klipp såret kan tas bort 7 eller fler dagar efter operation.

III. Oral sondmatning Administration

1. Använd en 18 ~ 20 G sondmatning nål eller inmatningsrör med en rundad spets. Den sondmatning Nålen ska vara längre än avståndet från spetsen på djurets huvud till sin sista revbenet.
2. Kontrollera djurens identifikationsnummer och observerbara hälsa. Försiktigt nackskinnet djuret genom att ta tag i huden över axlarna med tummen och fingrarna. Den återhållsamhet bör vara precis fast nog för förgrunden lemmar skall utsträckas till varje sida och ur vägen. Djuret ska inte kunna gripa efter nålen.
3. Dra försiktigt tillbaka djurets huvud med pekfingret som bildar en rak linje genom hals och matstrupe. Stöd djurets rygg med insidan av tummen.
4. Skonsamt och utan kraft, sätta in sondmatning nålen vid endera sidan av munnen och över tungan. I en jämn rörelse, bör nålen passerar mot gommen och ner i matstrupen. Gravity bör vägleda ner nålen utan att möta motstånd. Om det finns någon resistance, ta bort nålen och börja om igen. Djurets gag och svälja reflex kan utlösas under införande. Dock bör det inte finnas något motstånd eller flämtar från djuret. Det är viktigt att se till att djuret andas när nålen är på plats genom att kontrollera förflyttning av näsborrarna och bröst.
5. Tryck långsamt in sprutkolven att dosera dosen volym.
6. Ta försiktigt bort sondmatning nålen i samma vinkel och väg som det som det var isatt ner i matstrupen.
7. Tillbaka djuret till sin bur och övervaka andning och beteende för 5 ~ 10 minuter.

IV. In Vivo avbildning

Vi använder klave Life Sciences för att bevaka hur de celler injiceras i intrabursal hålighet. Försök med detta system har normalt en tidshorisont på 4 ~ 16 veckor från tiden för tumören implantation.

1. Bered lösningen av D-luciferin (substrat i Firefly luciferas) genom att lösa 5 ~ 20 mg i 1 ml PBS och filtrering genom 0,22 ìm membran för sterilisering.
2. Ladda induktionskammare genom att vrida på både syre och isofluran gas. Slå PÅ gasflöde till induktionskammare bara. Den isofluran flödet hålls på en låg nivå fram till djuren är redo att avbildas.
3. Kontrollera djurens identifikationsnummer och observerbara hälsa. Placera djuret i induktionskammare laddade med isofluran gas.
4. Ta bort djuret från kammaren när djuret verkar vara sövd. Leverera 200 mikroliter av beredda luciferin lösning via IP-injektion med 30 G nål. Det är viktigt att anteckna tiden för injektion för att hålla tiden konsekvent mellan luciferin injektion och bildhantering prestanda under hela studien.
5. Placera luciferin-injicerade djuret tillbaka in i induktion kammaren.
6. Ställ Imaging System till rätt inställningar. Var noga med att initiera systemet innan det allra första djuret bilden.
7. Stäng av gasflödet till induktionskammare och slå på gasflöde till avbildning kammaren.
8. Placera sövda djur rygg eller ventrala sidan uppåt. Se till att placera djurens näsan i en noskon att upprätthålla korrekt anestesi induktion. Se till att djuret är inom "punkt av intresse nätet" som indikeras av grön belysning.
9. Stäng dörren till kammaren och hämta bilden vid lämplig tidpunkt. Tiden kan fastställas genom kinetik.
10. Ta bort djuret från avbildning kammaren och lägg den tillbaka till sin bur. Övervaka djurens återhämtning som beskrivs i "Intrabursal Injection".

V. representativa resultat

Figur 1. In Vivo avbildning av celler äggstockarna tumör i en orthotopic musmodell. OVCAR5 celler som uttrycker luciferas injicerades intrabursally till höger äggstock och avbildat över tiden. Bilderna togs 13 (vänster), 17 (mitten) och 22 (höger) dagar efter injektionen med IVIS systemet Spectrum avbildning. Ryggsidan visas i övre panelen och ventrala sidan är lägre panelen. Observera att peritoneal spridning av tumörceller 22 dagar efter injektion.

Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Fox Chase Cancer Center Institutional Animal Care och användning kommittén.

Discussion

Äggstockscancer är den vanligaste dödsorsaken bland alla gynekologiska maligniteter ^1. Den höga dödligheten i denna sjukdom beror till stor del sin sena diagnos och bristen på tillförlitliga diagnostiska metoder ^2. Dessutom möter konventionell kemoterapi ofta chemoresistance och återfall av cancer ^3. Därför är nya behandlingar krävs för att effektivt rikta denna sjukdom. Vid utveckling av nya terapi riktar mänskliga äggstockscancer är det viktigt att utveckla en representativ djurmodell.

En orthotopic djurmodell har fördelar jämfört med konventionell xenograft modeller (t.ex. subkutan eller intraperitoneal injektion av tumörceller) genom att 1) ​​den återger den primära platsen för tumörbildning, 2) den representerar vanliga platsen för metastaser, och 3) den ger tumörceller till interagera med lämplig mikromiljö ^{4, 5, 6, 7, 8.} Gnagare har en unik bursal membran som omger äggstocken och är kontinuerlig med äggledare. Denna unika anatomi gnagare kan injektion av celler äggstockarna tumör orthotopically. Intrabursally sprutas äggstockarna tumörceller beter liknar mänskliga sjukdomar, och därigenom växer inom intrabursal membranet och sprids till bukhålan som tumören fortskrider. Injektion av celler som stabilt uttrycka luciferases eller fluorescerande proteiner kan också spåra beteendet hos tumörceller i realtid. Bioluminescent och / eller fluorescerande bildteknik gör det möjligt att upprepade gånger bilden tumörceller under en längre tid och studera tumörtillväxt, distribution och inskränkningar i det icke-invasiv sätt ^{9, 10, 11.}

Vid fastställandet av orthotopic modellen, är det viktigt att snabbt ta bort nålen från Bursa efter injektionen. Abrupt bort nålen tätar punktionsstället och förhindrar läckage av injicerade cellerna. Men på samma gång bör rörelsen vara varsam att inte slita Bursa. Om läckage uppstår under injektion kan det orsaka celler till utsäde i buken och eventuellt förvirra studien, dvs tidig sprider sig utanför äggstocken. I detta fall bör de särskilda djur ska registreras och följas för utvecklingen av flera olika tumörerna i bukhinnan före behandlingen alternativt elimineras från den efterföljande analyser. Innan du utför oral sondmatning, är det viktigt att kontrollera längden på sondmatning röret genom att mäta från toppen av djurets huvud till sista revbenet. Det är bra att markera röret vid djurets nos och inte passerar röret förbi detta märke. Införande av röret förbi denna märkning kan leda till en perforation till magen. Fastställa längden på röret är särskilt viktigt med unga djur eller djur som väger under 20 g. Vid insättning av sondmatning nålen ner i matstrupen bör det inte finnas något motstånd eller kamp från djuret. Det är viktigt att inte administrera lösning eller suspension för snabbt då detta kan leda till reflux och därefter leverera felaktiga dosen volym, samt lagt stress djuret. För jämförbara avbildning resultat från gång till gång är det önskvärt att hålla tiden konsekvent mellan injektion av luciferas substrat och bildhantering. Tidsinställd kan bestämmas genom att ta serie bilder efter substrat injektion och observera kinetik av signaler. Utveckling av en orthotopic musmodell av äggstockscancer, muntliga leverans av läkemedel, och in vivo-avbildning är nödvändiga tekniker för bättre förståelse av utvecklingen och spridningen av äggstockscancer och bedöma nya terapeutiska regimer som i slutändan kan förbättra resultatet av patient med denna dödliga sjukdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796