בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Summary

במודלים של בעלי חיים orthotopic של סרטן השחלות לשכפל טוב יותר מחלות אנושיות, ולכן לשפר את ההבנה שלנו של התקדמות סרטן תגובת הגידול לטיפול. מודל העכבר מקבל זריקה intrabursal של בלוציפראז-להביע תאים סרטניים בשחלות. טיפול מנוהל באמצעות gavage הפה. הגידול מנוטרת על ידי

Abstract

סרטן האדם התגובה לטיפול מיוצג יותר במודלים של בעלי חיים orthotopic. מאמר זה מתאר את התפתחות מודל העכבר orthotopic של סרטן השחלות, טיפול בסרטן באמצעות מתן תרופות דרך הפה, וניטור של התנהגות תאים סרטניים בתגובה טיפול תרופתי בזמן אמת באמצעות מערכת הדמיה vivo. במודל זה orthotopic, תאים סרטניים בשחלות להביע בלוציפראז הן למריחה על העור, על ידי הזרקת אותם ישירות לתוך בורסה עכבר שבו כל השחלה היא סגורה. עם הזרקה של D-luciferin, מצע של גחלילית בלוציפראז, בלוציפראז-לבטא בתאי ליצור אותות פליטת אור. אות זה הוא זוהה על ידי מערכת הדמיה vivo ומאפשר פולשני אמצעי ניטור הגידול, הפצה, רגרסיה בעלי חיים בודדים. והתרופות gavage דרך הפה מאפשר נפח המינון המקסימלי של 10 מ"ל / ק"ג משקל גוף להיות ישירות הקיבה דומה אספקת תרופות וטיפולים רפואיים. לכן, הטכניקות המתוארות כאן, פיתוח מודל העכבר orthotopic של סרטן השחלות, משלוח של תרופות דרך הפה, ו in vivo הדמיה, שימושיות עבור הבנה טובה יותר של סרטן השחלות טיפול האדם וישפר מיקוד המחלה הזאת.

Protocol

I. הכנה של תאים סרטניים השחלות

1. לגדול סרטן השחלות שורות תאים להביע בלוציפראז בתרבות. מקורות בלוציפראז ניתן Firefly, Renilla, או מינים אחרים. תאים להביע את חלבוני ניאון יכול לשמש גם. להדגמה זו אנו משתמשים בסרטן השחלות התא קו, OVCAR5, להביע גחלילית בלוציפראז.
2. קציר תאים באמצעות טכניקה שגרתית תרבית תאים.
3. שמור את ההשעיה תא (10,000 תאים / μL) ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) על הקרח עד זמן ההזרקה.

השנייה. Intrabursal Injection

הליך זה מחייב סיוע מאדם נוסף. כל הנהלים כירורגית מתבצעת בתנאים aseptic. זה כולל לבוש בלבוש כירורגית באמצעות מכשירי ניתוח סטרילי, מזרק, ומחטים.

1. הכן את ההרדמה על ידי ערבוב 3 מ"ל של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג / מ"ל), 1.6 מ"ל של hydrochloride xylazine (100 מ"ג / מ"ל), 1.5 מ"ל של acepromazine (10 מ"ג / מ"ל), ו 20 מ"ל של נתרן כלוריד 0.9%.
2. בדוק את מספר הזיהוי של בעלי חיים בריאות הנצפה. להרדים את החיה עם ההרדמה קטאמין-xylazine-acepromazine מוכן באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal עם נפח מנה של 8 ~ 9 מ"ל / ק"ג משקל גוף (BW).
3. ודא החיה תחת רגיל מקובלת של הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עם מלקחיים או אצבעות רגליו האחוריות של החיה. אם יש דוושת רפלקס, לחכות מישור עמוק יותר של הרדמה עד החיה אינו מגיב על הליך זה.
4. הנח את צד הגב חיה על כרית גזה סטרילי עם הראש שלה מול משם בזנב מול כלפיך. נקודת החתך ממוקם שמאלה או ימינה של קו האמצע ומעל השחלות. גילוח או להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% בנקודת החתך.
5. הרם את העור הרטובות בעזרת מלקחיים לעשות חתך קטן עם מספריים במיקום dorsomedial ישירות מעל למקלדת השחלות שומן. כרית שומן השחלות צריך להיות גלוי מתחת לפני השטח של קיר הבטן. כרית השומן לזיהוי בקלות על ידי צבע לבן שלה לעומת רקמת ורוד כהה המקיפים אותו.
6. הרם בעדינות את בטנה קיר הבטן ולעשות חתך קטן כמתואר לעיל (5).
7. הניחו כרית ספוג גזה סטרילי מלוחים על קו האמצע הסמוך החתך. אתר את כרית השחלות שומן בעדינות למשוך אותו החוצה והשאר זה על גבי גזה. לייצב את השחלה על ידי כיווץ כרית שומן עם קליפ בולדוג. על פי עמדה לנתח מיקרוסקופ, השחלה כדי לאפשר החדרת המחט (30 מד, ז) לתוך לכופף את אבובית oviduct המובילים בבורסה. כאשר המחט מוחדרת לתוך המיקום הנכון, זה צריך להיות גלוי תחת בורסה.
8. דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק להזריק 5 μL ההשעיה תא בין בורסה לבין השחלה בעוד מזרק ממוקם באתר ההזרקה. צעד זה דורש שני אנשים. אדם אחד דוחף את הבוכנה, בעוד אדם אחר טוען המיקום של המחט. הסר את המחט במהירות לאטום את האתר לנקב בעדינות אבל מספיק כדי לא לקרוע את אמתח ו אבובית. בורסה צריכה להיראות קצת נפוחה עם זריקה נכונה.
9. שחרר את כרית השומן קליפ בולדוג בעדינות להחליף את מערכת הרבייה ובחזרה כרית השומן לתוך חלל הצפק. בעדינות לסגור את הקיר על ידי משיכת הגוף רירית הבטן העליונה מעל בטנה התחתונה. סגור את העור עם סיכות כירורגי או קליפים הפצע.
10. מניחים את החיה מחלים לכלוב שלה לספק מקור חום בטוח כדי למנוע היפותרמיה להאיץ התאוששות. נטר את קצב הנשימה וקלות, החזרת טונוס שרירים, ואת היכולת לנוע מרצונם החופשי. כל אלה הם סימנים של התקדמות טובה לקראת התאוששות. סטייפלס או קליפים הפצע ניתן להסיר 7 ימים או יותר לאחר ניתוח.

ג. מינהל Gavage אוראלי

1. השתמש 18 ~ 20 מחט G gavage או צינורית האכלה עם קצה מעוגל. מחט gavage צריך להיות לא יותר מאשר המרחק מקצה ראשו של בעל החיים הצלע האחרונה.
2. בדוק את מספר הזיהוי של בעלי החיים ובריאות הנצפה. בעדינות עורף החיה ידי אחיזה בעור על הכתפיים עם האגודל והאצבעות. איפוק אמור להיות תקיף מספיק עבור גפיים קדמי להיות מורחב לכל צד ו מהדרך. חיה לא אמור להיות מסוגל לתפוס את המחט.
3. משוך בעדינות את הראש לאחור של החיה עם האצבע המורה, ויוצרים קו ישר דרך הצוואר והוושט. תמיכה לאחור של החיה עם החלק הפנימי של האגודל.
4. בעדינות ובלי כוח, הכנס את המחט gavage משני צדי הפה על הלשון. בתנועה חלקה אחת, המחט צריכה לעבור כנגד גג הפה לאורך הוושט. Gravity צריכים להנחות את המחט בלי התנגדות לפגישה. אם יש כל resistance, להוציא את המחט ולהתחיל מחדש. איסור פרסום של בעלי חיים רפלקס לבלוע עשוי להיות מופעלות במהלך הכניסה. עם זאת, לא אמורה להיות שום התנגדות או מתנשף מן החיה. חשוב לוודא כי בעל החיים הוא נושם כאשר המחט נמצאת במקום על ידי בדיקת תנועת הנחיריים והחזה.
5. לאט לאט לדחוף את הבוכנה של המזרק לוותר נפח המנה.
6. הוצא בעדינות את המחט gavage בזווית מסלול אותו כדרך זה הוכנס במורד הוושט.
7. מחזירים את החיה לכלוב שלה נשימה לפקח על התנהגות 5 ~ 10 דקות.

IV. Imaging in vivo

אנו משתמשים Caliper מדעי החיים לפקח על התנהגותם של תאים שהוחדר לתוך חלל intrabursal. ניסויים באמצעות מערכת זו בדרך כלל יש פרק זמן של 4 ~ 16 שבועות ממועד ההשתלה הגידול.

1. הכן את הפתרון של D-luciferin (המצע של גחלילית בלוציפראז) על ידי המסת 5 ~ 20 מ"ג 1 מ"ל PBS וסינון דרך הממברנה 0.22 מיקרומטר עיקור.
2. טעינת קאמרית אינדוקציה ידי הפעלת חמצן והן גז isoflurane. הפוך על זרימת הגז לתא אינדוקציה בלבד. קצב זרימת isoflurane נשמר ברמה נמוכה עד חיות מוכנים הדמיה.
3. בדוק את מספר הזיהוי של בעלי החיים ובריאות הנצפה. מניחים את החיה בחדר אינדוקציה מואשם גז isoflurane.
4. הסר את החיה מן החדר כאשר החיה נראית רדומה. ספק 200 μL של פתרון luciferin מוכן באמצעות הזרקה IP באמצעות מחט 30 G. חשוב לרשום את זמן ההזרקה על מנת לשמור על עקביות בין זמן ההזרקה luciferin וביצועים הדמיה לאורך כל תקופת המחקר.
5. הנח את גב luciferin-מוזרק חיה לתוך תא אינדוקציה.
6. הגדר את מערכת הדמיה את ההגדרות המתאימות. הקפד לאתחל את המערכת לפני הרכישה את התמונה החיה הראשונה.
7. לכבות את זרימת הגז לתא אינדוקציה ולהדליק את זרימת הגז לתא הדמיה.
8. מניחים את הגב חיה בהרדמה או בצד הגחון למעלה. הקפידו למקם את האף של החיות בצורת חרוט האף כדי לשמור על אינדוקציה הרדמה תקין. ודא החיה בתוך "נקודת עניין של רשת" כפי שצוין על ידי אור ירוק.
9. סגור את הדלת של החדר ולרכוש את התמונה בזמן המתאים. הזמן יכול להיקבע על ידי קינטיקה.
10. הסר את החיה מבית הבליעה הדמיה ולמקם אותו חזרה לכלוב שלה. צג התאוששות של החיות כפי שתואר "הזרקת Intrabursal".

V. תוצאות נציג

איור 1. הדמיה Vivo של תאים סרטניים בשחלות במודל עכבר orthotopic. OVCAR5 תאים להביע בלוציפראז הוזרקו intrabursally לתוך השחלה ימין צילמו לאורך זמן. תמונות צולמו 13 (משמאל), 17 (באמצע), ו 22 (ימין) ימים לאחר ההזרקה באמצעות מערכת הדמיה IVIS ספקטרום. בצד הגב מוצג בלוח העליון בצד הגחוני הוא בפאנל התחתון. שים לב כי התפשטות של תאים סרטניים הצפק 22 ימים לאחר ההזרקה.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים Fox Chase Cancer Center של ועדת שימוש.

Discussion

סרטן השחלות הוא הגורם המוביל למוות בין כל מחלות ממאירות גניקולוגיים ^1. שיעור התמותה גבוה של מחלה זו נובעת בעיקר אבחון מאוחר שלה והיעדר שיטות אבחון אמין ^2. יתר על כן, לעתים קרובות כימותרפיה קונבנציונלית מפגשים chemoresistance ו הישנות של סרטן ^3. לכן, רומן הרפוי נדרש למקד באפקטיביות את המחלה הזאת. בפיתוח טיפול חדש לסרטן השחלות מיקוד האדם, חשוב לפתח מודל החיה נציג.

מודל החיה orthotopic יש יתרונות על פני מודלים xenograft קונבנציונאלי (למשל תת עורית או זריקות intraperitoneal של תאים סרטניים) כי ב 1) היא משחזרת את האתר הראשי של היווצרות הגידול, 2) היא מייצגת אתר משותף של גרורות, ו 3) הוא מספק תאים סרטניים אל אינטראקציה עם microenvironment המתאים ^{4, 5, 6, 7, 8.} מכרסמים יש קרום bursal ייחודי המקיף את השחלה, והוא רצוף עם oviduct. זה האנטומיה הייחודית של מכרסמים מאפשר הזרקה של תאים סרטניים בשחלות orthotopically. מזריקים תאים סרטניים בשחלות Intrabursally להתנהג בדומה מחלות אנושיות, ובכך גדל בתוך קרום intrabursal והפצת לתוך חלל הצפק עם התקדמות הגידול. הזרקה של תאים luciferases ביציבות להביע או חלבוני ניאון מאפשרת גם מעקב אחר התנהגותם של תאים סרטניים בזמן אמת. Bioluminescent ו / או טכנולוגיית הדמיה ניאון מאפשרת שוב ושוב תאים סרטניים התמונה על פני תקופה ממושכת של זמן הגידול המחקר צמיחה, הפצה, רגרסיה בצורה לא פולשנית ^{9, 10, 11.}

בהקמת מודל orthotopic, חשוב להסיר במהירות את המחט מתוך בורסה על הזריקה. הסרה פתאומית של חותמות מחט לנקב את האתר ומונע זליגה של התאים מוזרקים. עם זאת, באותו הזמן, התנועה צריכה להיות עדין לא לקרוע את בורסה. אם הדליפה מתרחשת במהלך ההזרקה, זה יכול לגרום לתאים זרע בבטן ואפשרות לבלבל את המחקר, כלומר, הפצת מוקדמת מחוץ השחלה. במקרה זה, חיה הספציפי צריך להיות מוקלט בעקבות לפיתוח אתרי גידולים מרובים הצפק לפני הטיפול, או לחילופין לבטל מן הניתוחים שלאחר מכן. לפני ביצוע gavage אוראלי, חשוב לבדוק את אורך הצינור gavage ידי מדידת מקצה ראשו של בעל החיים הצלע האחרונה. זה מועיל כדי לסמן את התחתית אפו של בעלי חיים לא להעביר את הצינור בעבר סימן זה. החדרת הצינור בעבר סימן זה יכול לגרום נקב בבטן. קביעת אורכו של הצינור הוא חשוב במיוחד עם בעלי חיים או חיות צעירות מתחת לגיל 20 גרם במשקל לאחר החדרת המחט gavage למטה הוושט, לא אמורה להיות שום התנגדות או מאבק של החיה. חשוב לא לנהל את הפתרון או השעיה מהר מדי כמו זה יכול להוביל רפלוקס ולאחר מכן לספק נפח במינון מדויק, כמו גם הוספת מתח לחיה. לקבלת תוצאות הדמיה דומה מעת לעת, רצוי לשמור על עקביות בין זמן ההזרקה של המצע הדמיה בלוציפראז ו. לשגות הזמן ניתן לקבוע על ידי לקיחת סדרה של תמונות לאחר ההזרקה המצע ולבחון את קינטיקה של אותות. פיתוח מודל העכבר orthotopic של סרטן השחלות, משלוח של תרופות דרך הפה, ו in vivo הדמיה טכניקות הכרחי להבנה טובה יותר של התפתחות והתפשטות של סרטן השחלות להערכת משטרי טיפולית חדשנית שעשויים בסופו של דבר לשפר את התוצאה של חולה עם מחלה זו קטלני.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796