Summary
난소암의 Orthotopic 동물 모델은 더 나은 인간의 질병을 복제하기 때문에 암 진행 및 치료 종양 반응의 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 모델 루시페라제 - 표현 난소 종양 세포의 intrabursal 주사를 받게됩니다. 치료는 경구 gavage를 통해 관리합니다. 종양 성장에 의해 감시
Abstract
인간의 암 치료에 반응이 좋은 orthotopic 동물 모델로 표현됩니다. 본 논문은 난소암의 orthotopic 마우스 모델, 생체내 이미징 시스템에 사용 실시간으로 약물 치료에 대한 응답으로 종양 세포의 행동 구두 약물 전달 및 모니터링을 통해 암 치료의 발전을 설명합니다. 이 orthotopic 모델에서 루시페라제을 표현하는 난소 종양 세포는 각 난소가 포함되어 있습니다 마우스 부르사에 직접 주사하여 몸에 붙이기도 적용됩니다. D - luciferin, 반딧불 루시페라제의 기판의 주사시, 루시페라제 - 표현 세포 bioluminescence 신호를 생성합니다. 이 신호는 생체내 이미징 시스템에 의해 감지하고 개별 동물에 종양의 성장, 유통, 그리고 회귀 모니터링의 비침습 방법을 허용합니다. 구두 gavage를 통해 약물 관리 10 ML / 위장에 직접 전달하는 kg의 체중의 최대 먹이지 볼륨을 허용하고 긴밀하게 임상 치료에서 약물 전달 유사합니다. 따라서, 기술, 여기에 난소암, 약물의 경구 전달하고, 생체내 이미징에의 orthotopic 마우스 모델의 개발을 설명하는 인간의 난소 암 치료 이해하는 데 유용합니다이 질병을 대상으로 향상됩니다.
Protocol
난소 종양 세포 I. 준비
- 문화 루시페라제을 표현하는 난소암 세포 라인을 성장. 루시페라제의 소스 반딧불, Renilla 또는 다른 종의 수 있습니다. 형광 단백질을 표현하는 세포도 사용할 수 있습니다. 이 예제의 경우 우리는 반딧불 루시페라제을 표현하는 난소암 세포 라인, OVCAR5를 사용합니다.
- 일상적인 세포 배양 기술을 이용하여 수확 세포.
- 칼륨의 세포 현탁액 (10,000 세포 / μL)는 사출 시간까지 얼음 호수 (PBS)를 버퍼 유지.
II. Intrabursal 사출
이 절차는 두 사람의 도움이 필요합니다. 모든 수술 절차는 무균 조건 하에서 실시하고 있습니다. 이것은 수술 복장을 입고 및 무균 수술기구, 주사기 및 주사 바늘을 사용하여 포함합니다.
- 케타민을 염산염 (100 MG / ML), xylazine 염산염의 1.6 ML (100 MG / ML), acepromazine (10 MG / ML)의 1.5 ML, 그리고 0.9 %의 나트륨 염화물의 20 ML 3 ML을 혼합하여 마취 솔루션을 준비합니다.
- 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. 8 선량 볼륨 ~ 9 ML / kg 체중 (BW)와 intraperitoneal (IP) 주입을 통해 준비 케타민을 - xylazine - acepromazine 마취와 동물을 마취.
- 동물이 동물은 뒷다리 발톱에 포셉 또는 손가락으로 발가락 핀치를 수행하여 마취의 수용 일반 아래에 있는지 확인합니다. 페달 반응이있다면 동물이 프로 시저에 응답하기 전까지, 마취의 깊이 일반 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
- 머리가 떨어져 직면하고 꼬리가 당신쪽으로 향하게과 멸균 거즈 패드에있는 동물 등의 측면을하다. 절개의 요점은 난소 위의 왼쪽 또는 오른쪽으로 정중선의 및 위치하고 있습니다. 절개 지점에 70 % 알코올로 모피를 면도 또는 젖었어.
- 포셉를 사용하여 침수 피부를 허용하고 dorsomedial 위치에 직접 난소 지방 패드 위에 가위로 작은 절개를합니다. 난소 지방 패드는 복막 벽의 표면 아래에 표시되어야합니다. 지방 패드 그것을 둘러싼 어두운 분홍색 조직 대조의 흰 색깔로 쉽게 알아볼 수 있습니다.
- 부드럽게 복막 벽을 라이닝을 리프트하고 위에 설명된대로 작은 절개 (5)합니다.
- 절개에 인접한 정중선에 멸균 생리 젖었 거즈 패드를 놓습니다. 난소 지방 패드를 찾아 조심스럽게 그것을 꺼내와 거즈로 그것을 휴식. 불독 클립과 지방 패드를 고정하여 난소를 안정화. 해부 현미경, 위치에 따라 난소로 부르사 이어지는 수란관 가느다란 관 벤드으로 바늘의 삽입 (30 게이지, G)를 허용합니다. 바늘이 적절한 위치에 삽입하면, 그것은 부르사에 따라 표시되어야합니다.
- 부드럽게 주사기가 주사 사이트에 위치하는 동안 부르사과 난소 사이의 세포 현탁액의 5 μL를 주입하는 주사기의 플런저를 밀어. 이 단계는 두 사람을 필요로합니다. 다른 사람이 바늘의 위치를 유지하는 동안 한 사람이 플런저를 못살게 굴지. 찔린 사이트를 밀봉하기 위해 신속하게 바늘을 제거하지만 부르사와 가느다란 관의 분열 부드럽게 충분하지. 부르사 약간 적절한 주사와 함께 커지는 것으로 나타납니다.
- 불독 클립에서 지방 패드를 출시하고 부드럽게 복막 구멍에 생식 트랙트 지방 패드를 다시 교체하십시오. 하단 안감을 통해 상부 복막 안감을 떼어하여 신체 벽을 부드럽게 닫습니다. 외과 스테이 플스 또는 부상 클립과 함께 피부를 닫습니다.
- 다시는 케이지에 복구 동물을 장소와 저체온증 방지 및 복구 속도를 안전한 열원을 제공합니다. 호흡 속도와 용이성, 근육 톤의 반환하고, 자발적으로 이동할 수있는 능력을 모니터링합니다. 이러한 회복을 향해 진보의 좋은 지표입니다. 스테이 플스이나 상처 클립은 7 일 이상 게시 수술을 제거할 수 있습니다.
III. 구강 Gavage 관리
- 둥근 팁과 함께 18 ~ 20 G gavage 바늘이나 수유 튜브를 사용하십시오. gavage 바늘이 동물의 머리 끝부분에서 마지막으로 갈비뼈의 거리보다 더 이상이어야합니다.
- 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. 엄지와 손가락으로 어깨를 통해 피부를 쥐고하여 부드럽게 아저씨 동물. 억제하는 방법의 각 측면과 밖으로 연장하는 포어 팔다리에 대한 충분 회사되어야합니다. 동물 바늘에서 파악하지 못할 수 있습니다.
- 부드럽게 목을과 식도를 통해 직선을 형성하여 검지 손가락으로 동물의 머리를 뒤로 당기십시오. 엄지의 안쪽과 동물 등을 지원합니다.
- 부드럽게하고 강제하지 않고, 입 양쪽에 있고 혀 위에 gavage 바늘을 삽입합니다. 단칼에에서 바늘은 입천장에 대한과 식도 아래로 통과해야합니다. 중력 회의 저항하지 않고 바늘을 안내합니다. 어떤 resistan가있다면CE는 바늘을 제거하고 다시 시작합니다. 동물의 개그와 삼키기 반사는 삽입하는 동안 발생 수 있습니다. 그러나, 저항이나 동물로부터 온다있을 수 없습니다. 동물이 바늘은 콧구멍과 가슴의 움직임을 선택하여 장소에있을 때 호흡 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
- 천천히 선량 볼륨을 하는걸 주사기의 플런저를 밀어.
- 부드럽게 그것이 식도를 삽입했던 방법과 동일한 각도와 경로에서 gavage 바늘을 제거합니다.
- 5 ~ 10 분 정도의 케이지와 모니터의 호흡과 행동으로 동물을 반환합니다.
IV. VIVO 영상에서
우리는 intrabursal 캐비티에 주입 세포의 동작을 모니터링하는 칼리퍼 생명 과학을 사용합니다. 이 시스템을 사용하는 실험은 일반적으로 종양 이식의 시간에서 4 ~ 16 주간의 기간이 있습니다.
- 1 ML PBS에 5 ~ 20 밀리그램을 분해하고 살균을위한 0.22 μm의 막을 통해 필터링하여 D - luciferin (반딧불 루시페라제의 기판)의 솔루션을 준비합니다.
- 산소와 isoflurane 가스 모두에 회전에 의해 유도 챔버를 부과합니다. 단지 유도 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 동물이 몇 군데 준비되기 전까지는 isoflurane 유량이 낮은 수준에서 관리하고 있습니다.
- 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. isoflurane 가스 충전 유도 챔버에있는 동물을 놓으십시오.
- 동물 anesthetized 것으로 나타납니다 때 챔버에서 동물을 제거합니다. 30 G 바늘을 사용하여 IP를 통해 사출 준비 luciferin 솔루션 200 μL를 제공합니다. 연구를 통해 luciferin 분사 및 이미징 성능 사이의 시간 일관성을 유지하기 위해 분사 시간을 기록하는 것이 중요합니다.
- 유도 챔버에 luciferin - 주입 동물 돌려 놓으십시오.
- 적절한 설정으로 이미징 시스템을 설정합니다. 최초의 동물 이미지를 인수하기 전에 시스템을 초기화해야합니다.
- 유도 챔버에 가스 흐름을 끄고 이미징 챔버에 가스 흐름을 켜십시오.
- anesthetized 동물 지느러미 또는 복부 측면을 놓으십시오. 적절한 마취 유도를 유지하기 위해 코 콘에있는 동물들의 코를 배치해야합니다. 동물과 같이 녹색 조명으로 표시 "이자 그리드의 시점"이내에 있는지 확인하십시오.
- 챔버의 문을 닫고 적절한 시간에 이미지를 획득. 시간은 동력학에 의해 결정하실 수 있습니다.
- 이미징 챔버에서 동물을 제거하고 그 케이지에 돌려 놓습니다. "Intrabursal 사출"에 설명된대로 동물들의 복구를 모니터링합니다.
V. 대표 결과
그림 1. orthotopic 마우스 모델에서 난소 종양 세포의 생체내 이미징에서. 루시페라제 표현 OVCAR5 세포는 바로 난소에 intrabursally 주입하고 시간이 지남에 따라 몇 군데 있었다. 이미지는 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 주사 후 13 일 (왼쪽), 17 일 (중간) 및 22 (오른쪽) 찍은. 도설 측면은 상단 패널에 표시하고 복부 쪽이 낮은 패널에서입니다. 참고 사출 다음과 같은 종양 세포의 복막 확산 22 일.
동물 실험 폭스 체이스 암 센터의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Discussion
난소암은 모든 gynecologic malignancies의 한 중 사망의 주요 원인이다. 이 질병의 높은 사망률은 늦은 진단하고 신뢰할 수있는 진단 방법 2의 부족으로 크게 때문입니다. 또한, 기존의 화학 요법은 종종 암 3 chemoresistance 및 재발 발생. 따라서, 소설 치료제가 효과적으로이 질병을 대상으로 필요합니다. 인간 난소암을 대상으로 새로운 치료의 개발에, 이것은 대표적인 동물 모델을 개발하는 것이 중요합니다.
orthotopic 동물 모델은 metastases 일반적인 사이트 대표)는 2 종양 형성의 주요 사이트를 재현)는 1 기존의 이종 이식 모델을 통해 장점 (예 : 피하 또는 종양 세포의 intraperitoneal 주사)을하고 있으며, 3)은 종양 세포를 제공합니다 적절한 microenvironment 4, 5, 6, 7, 8과 상호 작용. 설치류는 난소와 주변 수란관과 함께 지속되는 독특한 bursal 멤브레인 있습니다. 설치류의이 독특한 해부학 orthotopically 난소 종양 세포의 주입을 허용합니다. Intrabursally 주입 난소 종양 세포는 따라서 intrabursal 멤브레인 내에서 성장과 종양의 진행으로 복막 구멍에 전파, 인간의 질병에 유사한 동작합니다. 세포 안정 표현 luciferases 또는 형광 단백질의 주입은 또한 실시간으로 종양 세포의 행동을 추적하실 수 있습니다. 발광 생물 및 / 또는 형광 이미징 기술은 가능한 시간과 비침습 방식으로 9, 10, 11에서 공부 종양의 성장, 유통, 그리고 회귀의 연장 기간 동안 반복적으로 종양 세포 이미지 수 있습니다.
orthotopic 모델을 확립, 그것은 빠르게 주입시 부르사에서 바늘을 제거하는 것이 중요합니다. 돌발 바늘 물개 찔린 사이트의 제거 및 주입 세포의 누출을 방지합니다. 그러나, 동시에, 운동 부르사 찢어하지 부드럽게해야합니다. 누설은 주사하는 동안 발생하는 경우, 복부에 씨앗으로 세포를 일으킬 가능성이시기 상조가 난소 밖으로 확산 연구, 즉를 혼란시킬 수 있습니다. 이 경우, 특정 동물이 기록되어야하며 사전에 치료하거나 또는 이후 분석에서 제거하는 복막의 여러 종양 사이트의 발전을 위해 따라갔다. 전에 경구 gavage를 수행하기 위해, 그것은 동물의 머리의 끝에서 마지막 늑골을 측정하여 gavage 관의 길이를 확인하는 것이 중요합니다. 그것은 동물의 코에있는 튜브를 표시하는 도움이 마르크 지난 튜브를 전달하지 않습니다. 이 마크 지난 튜브의 삽입은 위장에 천공이 발생할 수 있습니다. 튜브의 길이를 결정하는 것은 20 세 미만 G. 무게 어린 동물 또는 동물과 특히 중요합니다 식도 아래 gavage 바늘의 삽입시, 동물의 저항이나 투쟁도 없을 것입니다. 이 환류로 이어질하고 이후 부정 확한 선량 볼륨을 제공할뿐만 아니라 동물에 스트레스를 추가 할 수처럼 그것은 너무 빨리 솔루션이나 정지를 관리하지 않는 것이 중요합니다. 수시로 비교 이미징 결과를 얻으려면, 그것은 루시페라제 기판 및 이미징의 주입 사이의 시간 일관성을 유지하는 것이 바람직하다. 시간 경과는 기판 주입 후 이미지의 시리즈를 복용하고 신호의 속도론을 관찰하여 결정하실 수 있습니다. 난소암, 약물의 경구 전달하고, 생체내 이미징에의 orthotopic 마우스 모델의 개발 개발 및 난소암의 확산의 더 나은 이해하고 궁극적으로이 치명적인 질환으로 환자의 결과를 향상시킬 수 있습니다 소설 치료 regimens을 평가 필요한 기술입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그의 전문 기술 지원에 대한 박사 하비 헨즐리 감사합니다. 동물 시설 및 스몰 애니멀 영상 시설의 실험실 :이 작품은 다음과 폭스 체이스 암 센터 (FCCC) 시설의 사용에서 이익. 이 작품은 FCCC / UPenn (P50 CA083638) FCCC 핵심 부여 (P30 CA006927)에서 난소암의 포자 및 난소 암 연구 기금에 의해 부분적으로 지원되었다.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine Hydrochloride | Vedco, Inc. | Not Available | |
| Xylazine Hydrochloride | Lloyd, Inc. | Not Available | |
| Acepromazine | Vedco, Inc. | Not Available | |
| D-Luciferin Potassium Salt |  Caliper Life Sciences |
122796 |
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