Intraperitoneal injektion i vuxen Zebrafish

Summary

Vi visar intraperitoneal injektion i vuxen zebrafisk. Vi använder en 10 l NanoFil mikrospruta kontrolleras av en Micro4 controller och UltraMicroPump III. Denna demonstration innefattar användning av kallt vatten som bedövningsmedel.

Abstract

En praktisk metod för att kemiskt behandla zebrafisk är att införa reagenset i tanken vattnet, där det kommer att tas upp av fisken. Men denna metod att det är svårt att veta hur mycket reagens absorberas eller tas upp per fisk. Några experimentella frågor, särskilt de som rör metaboliska studier, kan lösas bättre genom att leverera en viss mängd till varje fisk, baserat på vikt. Här presenterar vi en metod för intraperitoneal (IP) injektion i vuxen zebrafisk. Injektion i bukhålan, posteriort om bäckengördeln. Detta förfarande är anpassad från veterinärmedicinska metoder som används för större fiskar. Det är säkert, som vi har sett noll dödlighet. Dessutom har vi sett blödning vid injektionsstället i endast 5 av 127 injektioner, och i varje av dessa fall blödningen var kort, som varar flera sekunder, och mängden av förlorade blod var liten. Framgång med detta förfarande kräver varsam hantering av fisken genom flera steg inklusive fasta, vägning, anesthetizing, injektion, och återhämtning. Försiktighetsåtgärder krävs för att minimera stress under hela förfarandet. Vår innebär bland annat hjälp av en liten injektion volym och en 35G nål. Vi använder Cortland saltlösning som det fordon som osmotiskt är balanserade för insjöfisk. Luftning av gälarna bibehålls under injektionsproceduren genom att först föra fisken till en kirurgisk plan av anestesi, vilket gör att långsamma operculum rörelser, dels genom att hålla fisken i ett tråg i en vattenmättad svamp under injektionen själv. Vi visar nyttan av IP-injektion genom att injicera glukos och övervaka ökningen av blodsockernivån och senare återgå till det normala. Eftersom stress är känt för att öka blodsockret i teleost fisk, jämför vi blodsockernivåerna i fordons-injicerade och icke-injicerade vuxna och visar att förfarandet inte medför en betydande ökning av blodsocker.

Protocol

1. Pre-injektion Förberedelser

1. Snabba fisken i minst 24 timmar före injektion. Detta kommer att tömma tarmen glödlampan (magen) innehåll. Den grundläggande fasta protokollet är att överföra fisk, på normal densitet, till en ren tank, därefter undanhålla mat. För längre sikt fastan som kräver mer rigorösa villkor (t.ex. för blodsocker studier), se ytterligare överväganden i diskussionen.
2. Förbered Cortland saltlösning (Perry et al., 1984).
   För en 100 ml volym, lös följande i destillerat vatten:
   725 mg NaCl (124,1 mM)
   38 mg kaliumklorid (5,1 mM)
   41 mg Na ₂ HPO ₄ (2,9 mm)
   24 mg MgSO ₄ ∙ 7H ₂ O (1,9 mM)
   16 mg CaCl ₂ ∙ 2H ₂ O (1,4 mm)
   100 mg NaHCO ₃ (11,9 mm)
   4 g Polyvinylpyrrolidon (PVP) (4%)
   1000 USP enheter Heparin
   Filter, sterilisera och lagra vid 4 ° C.
3. Förbered mikroskop.
   • Täck mikroskop botten med plastfolie för skydd i händelse av spill.
   • Sätt en pappershandduk på toppen av plastfolie. Den kirurgiska tabellen kommer att sitta på toppen av pappershandduk.
   • Pre-justera fokus genom att visa den kirurgiska tabellen och fokusera på svampen.
   Tips: Sätt ditt finger på toppen av svampen och fokusera på det. Detta kommer att eliminera eller minimera ytterligare fokus justeras när fisken är på kirurgiska bordet.
4. Väg fisken.
   • Fyll en 500 ml bägare ca 1 / 3 fullt med fisk anläggning vatten.
   • Tare balansen.
   • Samla fisken med hjälp av ett nät. Wick överflödigt vatten bort från nätet och fisk genom att kort badda nätet på hushållspapper. Överför fisk till bägaren.
   • Väg fisken.
   • Överför fisken till en ren tank.
   • Överför varje vägde fisken till sin egen märkta tanken.
   • Beräkna injektionsvolym för varje fisk baserat på fiskens vikt.
5. Förbered sprutan och tillhörande injektionsutrustning. För injektion, rekommenderar vi en 35G avfasade stål nål och en 10 l NanoFil mikrosprutan. Förbered NanoFil sprutan och silflex rör enligt tillverkarens anvisningar. Det är viktigt att få bort eventuella luftbubblor från sprutan och slangen. Efter att ha fyllt sprutan och slangen, montera sprutan på pumpen, och programmet injektionsvolym för första fisk.
6. Förbered den kirurgiska tabellen.
   • Skär en mjuk svamp (t.ex. # L800-D, Jaece Industries) så att det är ca 20 mm i höjd. På det platta ansiktet, gör ett snitt som är 10-15 mm djup. Denna nedskärning är tråget som kommer att hålla fisken för injektion.
   • Ställ in svampen i en 60 mm petriskål.
   • Ställ petriskål med svamp i en lämplig storlek pipettspetsen låda lock. Locket måste vara stor nog att rymma vatten för att bidra till att upprätthålla svamp temperatur, men det bör vara grunt nog att inte komma i vägen. Vi använder ett lock från en P200 tips låda som är 11,4 cm L x 7,7 cm B x 1,5 cm D.
   Dessa tre poster monteras ihop (svamp i petriskål i fält lock) utgör den kirurgiska tabellen.
7. Förbered narkos.
   • Gör krossad is med hjälp av kuber av fisk anläggning vattnet.
   Tips: Använd typiskt brickor Ice Cube kommer det att ta tre brickor att söva 10-12 fisk.
   • Fyll en ren ishink med krossad is.
   • Sätt kirurgiska tabellen i en större behållare såsom en 2,4 liters Rubbermaid förvaring av livsmedel behållare.
   • Häll lite anläggning vatten (varmt) i den yttre behållaren och kirurgiska tabellen. Håll en reserv av varmt anläggning vatten i närheten.
   • Sätt en termometer i den yttre behållaren.

2. Anestesi, Injection och återställning

1. Placera narkos yttre behållaren plus kirurgiska bord intill mikroskopet. Har hink med is marker i närheten.
2. Ta vattentemperaturen ned till 17 ° C genom att lägga is chips. Viktigt: Gå inte under 17 ° C under detta steg.
3. Använd ett nät för att överföra fisken till den yttre behållaren.
4. Tillsätt långsamt is marker till behållaren för att få ner temperaturen till 12 ° C, under loppet av flera minuter.
5. Övervaka fiskens beteende: Vid 17 ° C eller något lägre, fisken vanligen kommer att sprida sina bröstfenor horisontellt, flämta, och har snabba operculum rörelser. När temperaturen sjunker, kommer fisken simmar långsammare och till slut sluta simma. Eftersom den kirurgiska plan anestesi närmade kommer flämtande stanna och gällock rörelser långsamt. Fisken är klar för injektion när den inte reagerar på att hanteras. För de flesta fiskar, 12 ° C är tillräckligt. Större fiskar kan behöva kallare waTER.
6. Eftersom den önskade temperaturen uppnås (~ 12 ° C eller kallare), tryck på svampen för att mätta den.
7. Håll fingrarna i det kalla vattnet tillräckligt så att de inte kommer att värma upp fisken och ta ut den ur narkos under hanteringen.
8. Med kalla fingrar försiktigt flytta fisken till botten av svampen. Placera fisken med buken upp och gälarna i tråget.
9. Snabbt överföra den kirurgiska tabellen till mikroskop scenen.
10. Arbeta snabbt, försiktigt in nålen i mittlinjen mellan bukfenor. Nålen ska peka cranially och läggas närmare bäckengördeln än till anus. Du ska kunna känna när nålen är djupt för att kroppen väggen. Injicera lämplig volym och dra ut nålen.
11. Efter injektion, omgående överlåta fisken tillbaka till sitt varma vatten (~ 28,5 ° C) tank för återvinning genom att lossa fisk från svampen över tanken vattnet.
    Tips: Om fisken inte börjar simma omedelbart hjälpa den att återhämta sig genom att försiktigt virvlande vatten till gälarna.
12. Kontrollera nålen. Ibland en skala kan kopplas och bör tas bort före nästa injektion.
13. För efterföljande injektioner, använd varmt anläggning vatten så att narkos temperaturen kammare vattnet tillbaka upp till 17 ° C innan inför nästa fisk.

3. Representativa resultat:

Figur 1. Representativa resultat efter intraperitoneal injektion på 0,5 mg / g glukos eller fordon. Fisk har fastat i 72 timmar före injektion. X-axeln visar tid, efter injektion. Medel ± SEM.

Discussion

Intraperitoneal injektion består av fem steg: fasta, vägning, anesthetizing, injektion, och återhämtning. För varje steg finns det goda exempel som kan garantera framgång. Framgång har en frisk fisk såväl patienten som en bra experimentell resultat.

Fastan: En 24-timmars snabbt bör tömma tarmen glödlampa. Denna praxis är hämtad från fisken veterinära litteraturen (t.ex. Brown 1993). Ytterligare fasta överväganden diskuteras nedan.

Långsiktiga fasta: Vi har funnit att en 72-timmars snabbt krävs för att sänka blodsockret till en basnivå före injektion (Eames et al, 2010.). Vi har också funnit att för glukos studier Det finns flera förfaranden som krävs för att säkerställa att fisken fastade ordentligt. Börja med en ren tank (inget skräp på botten). Tankarna ska vara offline, tydligt märkta som "fasta" och på en plats där entusiastisk fisk vårdpersonalen inte kommer att mata dem. Utvärdera den yttre miljön i tanken och vidta åtgärder för att hindra fisken från att bli stressad från störningar, som stress är känt att höja blodglukos (Chavin och Young, 1970;. Groff et al, 1999). Till exempel hade vi en fastande experiment där en radio opererats dagligen på bänken som höll fisken tankar. Vi fann att blodsockret var ovanligt hög och kom fram till att fisken var stressade av vibrationerna. En annan stressfaktor är överfulla. Fisk bör hållas vid en densitet som överensstämmer med god praxis fisk djurhållning. För rekommendationer, se Brand et al. (2002) och Westerfield (1995). Vi har haft goda resultat fastande vår fisk vid en densitet på 10-12 fisk i en 9 liters tank (med 3 lager av kulor att ta upp en del av denna volym). Separera könen kan orsaka stress, så vi rekommenderar att upprätthålla en blandad kön befolkning under fastan. Detta innebär att ägg kan läggas, och äggen måste vara bundet så att de inte kommer att ätas. Ett enkelt sätt att binda ägg är att täcka tankens botten med 2-3 lager av kulor. Vattnets kvalitet måste upprätthållas genom att ta bort ägg och avfall och genom att ersätta ca 10-15% av karets vatten, dagligen. För att ta bort ägg och avfall, hävert fungerar bra.

Vägning: Vid vägning av fisk som inte är sövda, bör försiktighet iakttas för att minimera överföring av vatten från nätet i bägaren, för att säkerställa korrekt vägning. Om nettot (med fisk) är torkas på hushållspapper, kan majoriteten av överflödigt vatten tas bort, och vikten kan mätas exakt. Det kan vara lättare att söva fisken före vägningen, men vi har inte testat möjliga effekter av anesthetizing en fisk två gånger på en dag. Vi har testat vår teknik genom att väga fisken först med nät / blotting metoden och sedan väger fisken efter att den har sövda, och försiktigt avtorkning. Vi fann ingen signifikant skillnad i vikt mellan de metoder (P = 0,7927, t-test). Dessutom testade vi om detta nät / blotting metoden påverkas blodsockret, i jämförelse med helt enkelt flytta fisken till bägaren så snart det är nettoredovisas (ingen blotting). Vi fann ingen signifikant skillnad i blodsockernivå mellan de två överföringsmetoder (P = 0,2241, t-test).

Anesthetizing: Kemisk anestesi kan vara lämpliga för många studier. Här har vi visat kallt vatten narkos som ett alternativ, eftersom många anestetika (inklusive tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), höja blodsockret. I tidigare studier har vi fastställt att kallt vatten inte höjer blodsocker i zebrafisk (Eames et al., 2010).
För kallt vatten narkos, bör temperaturen sänkas långsamt. Minskningstakten verkar bero på storleken på fisken, med mindre fisk att gå under snabbare än större fiskar. Efter injektionen kan man konstatera att fisken återhämtar sig alltför långsamt från narkos (se nedan). Detta kan resultera antingen när börjar temperaturen är för låg, eller när temperaturen sänks för snabbt. Utgångspunkten temperaturen är för låg om fisken böjar i sidled vid inträdet i vattnet. Om den börjar temperaturen är korrekt, kommer fisken behålla sin balans från början. Det kommer att rotera sina bröstfenor till horisontellt läge, flämta, och har snabba operculum rörelser. Vanligtvis kommer den att simma. Som temperaturen sjunker, kommer rörelser minskar och fisken kommer att förlora jämvikten. En kirurgisk plan av anestesi nås när fisken kan hanteras utan att reagera. För att behålla fisken i kirurgisk anestesi måste fingrarna vara kall, så förvara dem i vatten före hantering av fisken. Svampen måste också förvaras kallt vid samma temperatur som det vatten som används för anesthetizing fisken. Det är viktigt att mätta svampen med vatten som är sufficiently kallt att upprätthålla anestesi när fisken är placerad på den.

Injektion: Före företaget injektioner, kanske du vill dissekera minst en fisk för att få en känsla av kropp väggtjocklek. Detta kan hjälpa dig att bedöma hur långt nålen behövs för att infoga att komma in i bukhålan. Dessutom, som du sätter nålen, kan du känna kroppen väggen "ge" när nålen går in i bukhålan. Under injektionen, vidta åtgärder för att hålla patienten lycklig. Se till att svampen är mättad med rätt temperatur kallt vatten för att förhindra att fisk från återuppliva under injektion. En väl mättade och mjuk svamp är viktigt för att minimera skador på skalor och slem täcka huden. En väl mättade svamp är också viktigt för att hålla gälarna kolsyrat. Vi rekommenderar verkligen skummet svampen anges nedan under Material. Slutligen, när fisken bedövas, arbeta snabbt för att minimera tiden som fisken är under.

Återvinning: Fisken bör återhämta sig från anestesi nästan vid inträdet i varmt tanken vattnet. Om fisken börjar inte simma direkt, snurra försiktigt vattnet mot dess gälar att snabba återhämtning. Om återhämtningen är långsam, då fisken gick under för fort och du bör justera anestesi förfarandet på lämpligt sätt. De möjliga orsaker till långsam återhämtning diskuteras under Anesthetizing.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Foam Sponge	Jaece Industries	L800-D
60 mm Petri dish
Pipet tip box lid			not too deep, e.g. 1.5 cm
Plastic storage container			deep, e.g. 7 cm
Thermometer
Crushed ice			made from facility water
Warm facility water			1 liter or more
500 ml beaker			for weighing
NanoFil syringe	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL	or Hamilton syringe
35 gauge needle	World Precision Instruments, Inc.	NF35BV-2	beveled
Silflex tubing	World Precision Instruments, Inc.	SILFLEX-2
UltraMicroPump III and Micro4 controller	World Precision Instruments, Inc.	UMPS-1
Foot switch	World Precision Instruments, Inc.	15867
Dissecting microscope
Plastic wrap
Paper towels
Cortland salt solution