Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Summary

Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

Abstract

Molti farmaci e altre molecole di piccole dimensioni utilizzato per modulare la funzione biologica sono amphiphiles che adsorbono a doppio strato / soluzione di interfaccia e di conseguenza alterano le proprietà doppio strato lipidico. Questo è importante perché le proteine ​​di membrana sono energicamente il loro doppio strato accoppiato ad ospitare da interazioni idrofobiche. Cambiamenti nelle proprietà doppio strato così alterare la funzione delle proteine ​​di membrana, che fornisce un modo indiretto per amphiphiles di modulare la funzione delle proteine ​​e un possibile meccanismo di "off-target" effetti della droga. Abbiamo già sviluppato un test elettrofisiologico per rilevare i cambiamenti nelle proprietà doppio strato lipidico utilizzando canali gramicidina lineare come sonde ^3,12. Canali gramicidina sono mini-proteine ​​formata dalla dimerizzazione transbilayer di due subunità non conduttore. Essi sono sensibili ai cambiamenti nel loro ambiente membrana, che li rende potenti sonde per monitorare l'evoluzione delle proprietà doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning. Ora dimostrare un saggio a fluorescenza per la rilevazione di cambiamenti nelle proprietà doppio strato utilizzando gli stessi canali come sonde. Il test si basa sulla misurazione del tempo-corso di tempra fluorescenza da fluoroforo-caricato unilamellari vescicole grandi a causa dell'entrata di un quencher attraverso i canali gramicidina. Usiamo l'indicatore di fluorescenza / quencher paio 8-amminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl ⁺ che è stato utilizzato con successo in altri saggi di tempra fluorescenza ^5,13. Tl ⁺ permea il doppio strato lipidico lentamente ⁸ ma passa rapidamente attraverso lo svolgimento di canali gramicidina ^1,14. Il metodo è scalabile e adatto sia per studi meccanicistici e high-throughput screening di piccole molecole per doppio strato, perturbante, e le potenzialità "off-target", effetti. Troviamo che i risultati con questo metodo sono in buon accordo con precedenti risultati elettrofisiologici ^12.

Protocol

1. Genera ANTS pieno di liposomi

1. Il giorno 1, rimuovere il solvente da lipidi organici.
2. Togliere dal freezer lipidi e lasciarlo a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 0,6 mL di 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-phosphocholine) lipidi in soluzione cloroformio in un pallone basso a 25 mL.
4. Continuamente ruotare il pallone mentre si asciugava sotto azoto, fino a quando tutti i cloroformio è evaporato e un sottile velo bianco di mani lipidi tutta la metà inferiore del pallone.
5. A secco in un essiccatore sotto vuoto durante la notte.

1. Il giorno 2, la preparazione del campione con il fluoroforo che verrà incorporato nel vescicole.
2. Reidratare in 100 mM NaNO _3, 25 ANTS mM (Na sale), 10 mM HEPES. Usa HNO ₃ o NaOH per aggiustare il pH a 7,0. Ogni molecola ANTS ha 2 ⁺ Na, per un totale di 150 mm [Na ^+]. Aggiungere 1,671 ml di elettrolita per ottenere una sospensione di 10 lipidi mM.
3. Parafilm e vortice sospensione accuratamente.
4. Proteggere il campione dalla luce con un foglio e lasciare che l'età a temperatura ambiente per una notte.

1. Il giorno 3, fanno grandi vescicole unilamellari e rimuovere tutti i fluoroforo dall'esterno vescicole.
2. Ultrasuoni per 1 minuto in una bassa potenza ultrasuoni.
3. Gelo-disgelo campione 5-6 volte, ogni volta con 5 minuti in ghiaccio secco e 5 minuti in acqua calda (~ 50 ° C).
4. Estrudere la sospensione lipidica Avanti con un mini-estrusore. Impostare il mini-estrusore con un filtro in policarbonato 0,1 micron e filtro supporta (vedi manuale estrusore per maggiori dettagli). Estrudere la sospensione avanti e indietro 21 volte in modo tale che la sospensione finisce sulla siringa opposto. Quando più batch sono estrusi, ricordatevi sempre di caricare campioni con la stessa siringa. Durante l'estrusione la sospensione lipidica nuvoloso iniziale dovrebbe diventare quasi trasparente (sarà ancora giallo a causa del fluoroforo ANTS). Se l'estrusione diventa improvvisamente più semplice e meno pressione è necessaria per muoversi attraverso il filtro, il filtro può avere rotto e dovrà essere sostituita.
5. Rimuovere ANTS esterno eseguendo la sospensione estruso per un PD-10 colonna dissalazione utilizzando un protocollo gravità. Equilibrare colonna con 20-30 mL di Na-tampone (140 mM NaNO _3, 10 HEPES mM, pH 7.0, ricordatevi di usare HNO ₃ o NaOH per aggiustare il pH). Aggiungere 1,5 mL della sospensione lipidica estruso alla colonna e lasciar filtrare in Portare il volume totale del campione a 2,5 ml con l'aggiunta di 1 ml di Na-buffer. Dopo che il buffer è completamente incorporato nella colonna e nulla è fuoriuscita, eluire i liposomi con 3 ml di Na-buffer e raccogliere il campione risultante. L'ANTS risultante riempito LUV soluzione di riserva dovrebbe contenere circa 4-5 mm lipidi e appaiono traslucide bianco latte. Proteggere il campione dalla luce con un foglio.
6. Se la soluzione di riserva non viene utilizzata immediatamente, conservare a 13 ° C per un massimo di 7 giorni. Attenzione: non congelare o raffreddare la soluzione lipidica di sotto del suo liquido di cristallo fase temperatura di transizione (~ 12 ° C), in modo da distruggere l'integrità delle vescicole 'e il fluoroforo si fuoriuscire.

2. Mix Solution fluorescenza

1. 24 ore prima dell'uso, diluire liposomi e incubare con gramicidina (a 13 ° C). Equilibratura gramicidina monostrati tra interno ed esterno le vescicole lipidiche 'è un processo lento, che richiede una lunga incubazione.
2. Accuratamente il vortice ANTS pieno LUV soluzione madre come luvs hanno una densità> 1 g / mL e quindi sedimenti nelle soluzioni.
3. Miscelare il ANTS pieno LUV 1:20 stock in Na-buffer. Mescolare tutti liposomi per l'utilizzo in un giorno di esperimenti insieme in un pallone unico per migliorare l'uniformità del campione.
4. Separare 3 / 4 dei liposomi e aggiungere 260 Nm gramicidina pre-diluito in DMSO (500 mg / mL).
5. Per il restante 1 / 4 aggiungere lo stesso volume di DMSO (senza gramicidina) per mantenere costante la concentrazione di solvente in tutti i campioni.

3. Impostazione dello strumento di fluorescenza

1. Usiamo un Applied Photophysics SX.20 stopped-flow spettrofluorimetro con controllo di temperatura per misurare il tasso di estinzione di fluorescenza.
2. Girare gli strumenti per un'ora di anticipo per consentire il riscaldamento. I componenti sono: computer, unità di controllo elettronico, bagnomaria (sia raffreddamento e riscaldamento), di alimentazione della lampada e del serbatoio di azoto.
3. Impostare le condizioni di registrazione utilizzando il software Data Pro-SX.
4. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione monocromatore a 352 nm e aperture larghezza della fenditura per l'eccitazione di 1 / 1.
5. Utilizzare un λ = 455 nm filtro passa-alto per registrare l'emissione.
6. Utilizzare il "Hold Pressure" impostazione, che consente lo strumento per mantenere la pressione di azoto durante la registrazione e quindi evita le oscillazioni di pressione (e artefatti di registrazione) durante i primi pochi millisecondi.
7. Impostare "Time "a 1 s e" punti "a 5000.
8. Utilizzare la finestra di ripetizione e regolare il numero di ripetizioni, di solito usiamo 9 e 13 si ripete per buffer e gestisce quencher, rispettivamente.
9. Bagnomaria temperatura dovrebbe essere impostata a 25 ° C, la temperatura deve essere monitorata nel software SX.
10. Impostare il volume dell'unità a 120 microlitri, il che significa che ogni volta che lo strumento esegue un campione, si mescola 60 microlitri di ciascuna delle due siringhe. Con questa impostazione strumentale, un volume di 120 microlitri dà un tempo morto di ≈ 1,2 ms.
11. Regolare l'alta tensione (guadagno) sul rivelatore a fluorescenza per l'uscita del ANTS-liposomi ad essere circa 8. Per una miscela standard sperimentale il guadagno dovrebbe essere 400-420 V. Alcuni farmaci sono fluorescenti, tale da poter saturare il segnale di fluorescenza. In questi casi, guadagno / tensione deve essere ridotta.
12. Caricare sempre il campione fluorescente nella siringa sinistra e buffer / quencher nella siringa destra. Assicurati di fondo vortice tutti i campioni contenenti liposomi prima di caricarli, ed essere consapevoli che il luvs con il tempo si depositerà nella siringa.

4. Fare un esperimento

1. Preparare un campione di ANTS-caricato luvs sia con solventi o composti, e caricare nel spettrofluorimetro insieme sia con Na-tampone o Tl-quencher (50 mM TlNO _3, 94 mm NaNO _3, 10 HEPES mM a pH 7,0).
2. Utilizzare 1,5 ml diluito ANTS-LUV soluzione, con o senza gramicidina, preparate il giorno precedente.
3. Aggiungere il composto alla concentrazione desiderata o il solvente per i controlli. Mantenere la concentrazione di solvente al minimo e costante in tutti i campioni. La concentrazione dovrà essere regolato con una nuova (sconosciuto) composto per ottenere il desiderato dose-risposta gamma. Incubare per 10 minuti a 25 ° C al buio.
4. Il vortice LUV campione e caricare nella siringa sinistra. Caricare il Na-buffer o Tl-quencher nella siringa destra.
5. Rimuovere completamente le bolle d'aria da entrambi i campioni, spingendo le siringhe avanti e indietro.
6. Assicurarsi che entrambe le siringhe vengono caricate ugualmente prima di chiudere le valvole. Carico diseguale si tradurrà in pre-miscelazione di soluzioni prima che raggiungano la camera di registrazione.
7. Per il campione prima, registrare la fluorescenza con Na-tampone, ripetere 4 volte, regolare l'alta tensione (guadagno), se necessario, e ripetere 5 volte.
8. Per i restanti campioni, record di 9 ripete con Na-buffer.
9. Sostituire il Na-buffer con il TL-quencher e record di 13 ripetizioni.
10. Risciacquare con acqua e continuare con il campione successivo. Come controlli usiamo campioni: non gramicidina e con solvente, senza gramicidina e con la massima concentrazione del composto, sia con gramicidina e solvente.

5. Analisi dei dati

1. Trasferire i risultati al computer di analisi. Leggi tutti i dati in MATLAB per l'analisi. Per ogni campione, leggere in tutti i buffer e ripete quencher, escludendo i primi quattro in ogni caso, come quelli contenenti artefatti di miscelazione. Assumendo un volume dell'unità di 120 microlitri ci vuole un po 'meno di quattro colpi per cancellare completamente la miscela precedente dal stopped-flow tubo.
2. Le ripetizioni di buffer per tutti i campioni dovrebbero essere molto simili. Se c'è un cambiamento significativo nel segnale di fluorescenza, che dipende dalla concentrazione del composto, poi lo stesso composto può essere fluorescente e può essere necessario per sottrarre questo primo segnale di fluorescenza in più prima di normalizzare i campioni.
3. Manualmente passare attraverso le tracce e rimuovere "cattivo" ripete: ripete contenenti chiodi o deviazioni dalla multi-exponentiality a causa di artefatti di miscelazione e / o bolle.
4. Normalizzare la ripete quencher al valore medio di partenza delle ripetizioni di buffer per ogni campione. Combina le medie di tutti i campioni in un grafico per la visualizzazione.
5. Le tracce registrate senza gramicidina dovrebbero essere tutti simili e mostrano quasi nessun tempra fluorescenza, ci può essere una riduzione lenta del segnale di fluorescenza a causa della lenta perdita di Tl ⁺ attraverso il doppio strato vescicole 8. Se il campione senza gramicidina e nessun modificatore mostra tempra notevole, poi le vescicole si sono deteriorati e non deve essere più riutilizzato. Se i campioni senza gramicidina ma con il modificatore spettacolo tempra significativo, allora il modificatore perturba il doppio strato vescicole a tal punto che permette al fluoroforo o quencher per attraversare il doppio strato.
6. Se il composto altera le proprietà doppio strato lipidico, come rilevato da canali gramicidina, la durata fluorescenza sarà visibilmente alterato.
7. Per ogni campione, un esponenziale allungato ad esempio, ⁴⁾ è in grado di primi 200-100 ms della curva normalizzata quenching di fluorescenza delle ripetizioni individuali e il tasso di ⁴calcolato a 2 ms. Medie e deviazioni standard sono calcolati per un dato campione di tutte le ripetizioni individuali.
8. Infine, determinare la variazione relativa del tasso di quench normalizzando al campione di controllo più vicino nel tempo che ha gramicidina e nessun modificatore.

6. Rappresentante Risultati

Figura 1: Gli elementi essenziali della fluorescenza tempra a base di test per rilevare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico alto a sinistra:. Uno zoom-in su una vescicola lipidica singolo con ANTS più NaNO ₃ all'interno e NaNO ₃ più ₃ TlNO sulla parte esterna. In alto a destra: il segnale di fluorescenza registrate usando (forma dall'alto in basso) ANTS pieno di vescicole senza quencher, con quencher, con quencher e pre-drogati con gramicidina 87, 260 e 780 nm. In basso: rappresentazione schematica del stopped-flow camera di miscelazione.

Figura 2: Una schermata dalla Pro-Data software SX che illustrano i vari pannelli riferimento nella descrizione del setup sperimentale.

Figura 3:. Determinazioni ripetere multiple del segnale di fluorescenza da ANTS-caricato luvs con Na-buffer I primi quattro ripetizioni sono sempre esclusi, in quanto contengono artefatti di miscelazione. Il tubo che collega il siringhe campione alla cella di miscelazione hanno un volume definito, quindi le ripetizioni primi ci darà una lettura di ciò che prima era nel tubo: acqua per ripetere 1 e 2, una combinazione di acqua e di esempio per ripetere 3, la maggior parte del campione per ripetere 4, e solo campione per le ripetizioni rimanenti.

Figura 4:. Determinazioni ripetere multiple del segnale di fluorescenza da ANTS-caricato luvs con Na-buffer e con Tl-quencher Le prime quattro si ripete sono stati rimossi da entrambe le condizioni. Inoltre, per il TL-quencher misurazioni, ripetere 8 deve essere rimosso a causa di artefatti, bolle d'aria più probabile.

. Figura 5: Effetto di capsaicina (Cap) sul corso del tempo tempra ANTS fluorescenza (A) normalizzato segnale di fluorescenza più di 1 s, punti grigi indicano i risultati di tutte le ripetizioni (n> 5 per condizione); linee rosse indicano la media di tutti ripete. (B) I primi 100 ms, punti grigi indicano i risultati di una singola ripetizione per ogni condizione; linee rosse sono allungati adatta esponenziale (2 - 100 ms) a quelle ripetizioni. La linea tratteggiata blu indica il segno 2 ms, il momento in cui viene determinato il tasso di tempra. In entrambi A e B la traccia in alto mostra i risultati in assenza di Tl ^+, per i prossimi due tracce mostrano i risultati in assenza del GA, con Tl ⁺ ± Cap; le quattro tracce mostrano risultati inferiori a 260 nm GA e Tl ^+, dove i numeri indicano [Cap] in micron. I tassi di tempra per mM Cap 0, 10, 30 e 90, come determinata dalla frequenza di un esponenziale allungata, sono 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 e 247 ± 27 (media ± sd, n> 8) , rispettivamente.

Discussion

Abbiamo dimostrato un veloce fluorescenza a base di test per determinare il potenziale di doppio strato modificando di farmaci ed altre amphiphiles di piccole dimensioni. Composti che modificano le proprietà doppio strato possono alterare la funzione delle proteine ​​di membrana in un indiretto, maniera aspecifica, contribuendo probabilmente a "off-target" effetti della droga. Il test sfrutta la potenza dei canali gramicidina come sonde per i cambiamenti nelle proprietà doppio strato ¹² che vengono rilevati da doppio strato-spanning proteine. I risultati ottenuti utilizzando la fluorescenza a base di analisi sono in buon accordo con i risultati di un solo canale esperimenti gA ^12, indicando che questo metodo può essere utilizzato per studi meccanicistici e per librerie di composti screening. Utilizzando la configurazione attuale del test possiamo testare decine di composti al giorno, che è uno a due ordini di grandezza superiore a quella velocità possibile utilizzando il canale singolo approccio. Non ci sono fondamentale rate-limiting passaggi della fluorescenza a base di test, il che significa che può essere esteso per l'esecuzione in vera modalità high-throughput. E 'possibile variare le soluzioni elettrolitiche del dosaggio e / o utilizzare diversa composizione lipidica per la luvs'. Vale la pena notare che alcune composizioni lipidiche possono separare dopo l'essiccazione, che richiedono sistemi di scambio rapido solvente invece di asciugatura / idratazione passaggi ^7.

Non è chiaro se esiste una relazione causale tra l'aumento di lipofilia porta di droga e crescente attrito nello sviluppo di farmaci ^10,11,17 e, in caso affermativo, quali sono i meccanismi sottostanti (s)? Tuttavia, poiché le proteine ​​di membrana tendono ad essere regolato da cambiamenti nel loro ambiente membrana ^2, sarebbe prudente verificare se i farmaci anfifiliche e conduce droga altera le proprietà pertinenti doppio strato lipidico e, in caso affermativo, a quale concentrazione? Amphiphile adsorbimento al doppio strato lipidico esaurirà la fase acquosa, quindi la concentrazione rilevante è la concentrazione libera nella fase acquosa che può essere ordini di grandezza inferiore alla concentrazione nominale del sistema, ad esempio ^6,9,16. Se una molecola desiderata (biologico) si verificano effetti a concentrazioni in cui altera le proprietà doppio strato, diventa importante distinguere tra il "non-specifici", doppio strato-mediata cambiamenti nella funzione della membrana di proteine, al contrario di effetti diretti a causa (ad alta affinità ) vincolante per una o più proteine ​​bersaglio. Conoscere il doppio strato, modificando la propensione di un cavo di droga, scoperto via convenzionale high-throughput screening, è quindi probabile che sia importante per le decisioni in merito al suo ulteriore sviluppo.

Qualsiasi amphiphile ad un certo concentrazione alterare alcune proprietà doppio strato. Considerazioni chiave quindi diventare: a quale concentrazione, e sono i cambiamenti nelle proprietà doppio strato rilevato da (doppio strato-spanning) proteine ​​di membrana? Qui si sfruttano le capacità di gramicidina di formare canali dimerizzazione transbilayer ^15. Questo li rende utili sonde per l'accoppiamento energetico tra doppi strati lipidici e proteine ​​doppio strato-embedded, e per esplorare se piccole molecole alterare le proprietà doppio strato che vengono rilevati da proteine ​​di membrana. Il test è veloce, affidabile e scalabile, e quindi adatto per entrambi gli studi biofisici e per lo screening di librerie di composti per i farmaci con un potenziale doppio strato-perturbante effetti.

Per ulteriori informazioni sui test, la verifica della efficacia del test, e confronto con il solo canale elettrofisiologia vedere ^12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidin	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Mini-Extruder kit	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 Desalting column	Sigma-Aldrich	54805