Gramicidin-baserade Fluorescens-analys, för fastställande av små molekyler Potential för modifiering av membranet Egenskaper

Summary

Vi inför en snabb fluorescens-baserad analys som övervakar graden av fluorescens släcka som ett mått på gramicidin kanal aktivitet. Den gramicidin kanaler används som molekylära kraftgivare att övervaka förändringar i membranet egenskaper som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner.

Abstract

Många läkemedel och andra små molekyler som används för att modulera biologiska funktionen är biomolekylära som absorberar vid tvåskiktsmembran / lösningen gränssnitt och därmed ändra egenskaperna membranet. Detta är viktigt eftersom membranproteiner är energiskt kopplade till sin värd tvåskiktsmembran med hydrofoba interaktioner. Förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter förändrar därmed funktionen membran protein, som ger ett indirekt sätt för biomolekylära att modulera proteiners funktion och en möjlig mekanism för "off-target" läkemedelseffekter. Vi har tidigare utvecklat en elektrofysiologisk test för att upptäcka förändringar i membranet egenskaper med hjälp av linjär gramicidin kanaler som sonder ^3,12. Gramicidin kanaler mini-proteiner som bildas av transbilayer dimerization av två icke-ledande subenheter. De är känsliga för förändringar i deras membran miljö, vilket gör dem kraftfulla sonder för övervakning av förändringar i fastigheter membranet som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner. Vi visar nu en fluorescens-test för att upptäcka förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter med samma kanaler som sonder. Analysen är baserad på mätning av tid loppet av fluorescens släcka från fluoroforen-loaded stora unilamellar blåsor på grund av införandet av en törstsläckare genom gramicidin kanaler. Vi använder fluorescerande indikator / quencher par 8-Aminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (myror) / TL ⁺ som framgångsrikt har använts i andra fluorescens släcka analyser ^5,13. Tl ⁺ genomsyrar membranet sakta ^8, men går lätt föra en gramicidin kanaler ^1,14. Metoden är skalbar och passar både mekanistiska studier och high-throughput screening av små molekyler för tvåskiktsmembran-störande, och möjligheter "off-target", effekter. Vi finner att resultat med denna metod är väl överens med tidigare elektrofysiologiska resultat ^12.

Protocol

1. Generera ANTS fyllda Liposomer

1. Dag 1, ta bort organiska lösningsmedel från lipider.
2. Ta bort fett från frysen och låt den anta rumstemperatur.
3. Tillsätt 0,6 ml 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) lipid i kloroform lösning till en 25 ml rund botten kolv.
4. Ständigt rotera kolven medan torkningen under kväve, tills alla kloroform har avdunstat och en tunn vit hinna av fett rockar hela nedre halvan av kolven.
5. Torka i exsickator under vakuum över natten.

1. Dag 2, förbereda provet med fluoroforen som kommer att införlivas i blåsor.
2. Rehydrera i 100 mm NaNO _3, 25 mm myror (Na salt), 10 mm HEPES. Använd HNO ₃ eller NaOH att justera pH till 7,0. Varje ANTS molekyl har 2 Na ^+, för totalt 150 mm [Na ^+]. Tillsätt 1,671 ml elektrolyt för att få en 10 fjädring mM lipid.
3. Parafilm och vortexa fjädring grundligt.
4. Skydda provet från ljus med folie och låt den ålder vid rumstemperatur över natten.

1. Dag 3, göra stora unilamellar blåsor och ta bort alla fluoroforen utanför blåsor.
2. Sonikera 1 min i en låg effekt sonicator.
3. Frys-tö-prov 5-6 gånger, varje gång med 5 minuter på torris och 5 minuter i varmt (~ 50 ° C) vatten.
4. Extrude lipid suspensionen med hjälp av en Avanti mini-extrudern. Ställ in mini-extruder med 0,1 ìm polykarbonat filter och filtret stöder (se extruderingssvetsmaskin manual för detaljer). Extrude suspensionen och tillbaka 21 gånger så att fjädringen hamnar på den motsatta sprutan. När flera partier är pressad, alltid komma ihåg att ladda prover med samma spruta. Under extrudering det grumliga initiala lipid suspension ska bli nästan genomskinlig (det kommer fortfarande att vara gul på grund av myrorna fluoroforen). Om extrudering plötsligt blir lättare och mindre tryck behövs för att gå igenom filtret, kan filtret ha spruckit och behöver bytas ut.
5. Ta bort externa ANTS genom att köra den extruderade fjädring över en PD-10 avsaltning kolonn med en gravitation protokoll. Jämvikt kolumn med 20-30 ml Na-buffert (140 mM NaNO _3, 10 mm HEPES, pH 7,0, kom ihåg att använda HNO ₃ eller NaOH för att justera pH). Tillsätt 1,5 ml av extruderade lipid fjädring i kolonnen och låta det sippra in att den totala mängden av provet med 2,5 ml genom att tillsätta 1 mL Na-buffert. När bufferten är helt införlivas i kolonnen och inget läcker ut, eluera liposomer med 3 ml Na-buffert och samla in den resulterande provet. Den resulterande fyllde ANTS LUV stamlösning skall innehålla ca 4-5 mm lipider och tycks genomskinligt mjölkvit. Skydda provet från ljus med folie.
6. Om beståndet lösningen inte används omedelbart, förvara vid 13 ° C i högst 7 dagar. Varning: Får ej frysas eller kyla lipid lösningen under dess flytande till kristall-fasövergång temperatur (~ 12 ° C), eftersom detta kommer att förstöra blåsor integritet och fluoroforen kommer att läcka ut.

2. Blanda Fluorescens Lösning

1. 24 timmar före användning, späd liposomer och inkubera med gramicidin (vid 13 ° C). Jämviktsinställning gramicidin mellan lipid blåsor "inre och yttre monolager är en långsam process som kräver en lång inkubationstid.
2. Grundligt vortex myrorna fyllda LUV stamlösning som LUVS har en densitet> 1 g / ml och kommer därför sediment i lösningarna.
3. Blanda myrorna fyllda LUV lager 1:20 i Na-buffert. Blanda alla liposomer för användning i en dag av experiment tillsammans i en enda kolv för att öka prov enhetlighet.
4. Skilja ut 3 / 4 av de liposomer och lägga till 260 nM gramicidin spätts i DMSO (500 mikrogram / ml).
5. Till resterande 1 / 4 lägga till samma volym DMSO (utan gramicidin) för att hålla koncentrationen av lösningsmedelsångor konstant i alla prover.

3. Ställa in Fluorescens instrumentet

1. Vi använder en tillämpad Photophysics SX.20 stoppas flöde spectrofluorometer med temperaturkontroll för att mäta graden av fluorescens släcka.
2. Slå på instrument på en timme i förväg för att möjliggöra värmas upp. Komponenterna är: dator, elektronisk styrenhet, vattenbad (både svalare och värmare), lampa strömförsörjning och kväve tanken.
3. Ställ in inspelningsförhållanden med Pro-Data SX programvara.
4. Ställ in våglängden monokromator excitation till 352 nm och skära öppningar bredd för excitation till 1 / 1.
5. Använd en λ = 455 nm högpassfilter att registrera utsläpp.
6. Använd "Pressure Hold"-inställning, vilket gör instrumentet för att upprätthålla kväve trycket under inspelningen och därmed förhindrar tryckvariationerna (och inspelning artefakter) under de första millisekunder.
7. Ställ in "Timig "till 1 s och" Points "för 5000.
8. Använd upprepa rutan och justera antal repetitioner, normalt använder vi 9 och 13 upprepar för buffert och driver törstsläckare, respektive.
9. Vattenbad temperatur bör sättas till 25 ° C, temperaturen bör övervakas i SX programvaran.
10. Ställ enheten volymen till 120 mikroliter, vilket innebär att varje gång instrumentet kör ett prov, den blandar 60 mikroliter från vardera av de två sprutor. Med denna instrumentella inställning, ger en 120 mikroliter volym en död tid ≈ 1,2 ms.
11. Justera högspänning (vinst) på fluorescens detektor för myrorna-liposomer utgång till runt 8. För en standard experimentell blandning vinsten bör vara 400-420 V. Vissa läkemedel är fluorescerande, så att de kan mätta fluorescenssignalen. I dessa fall bör vinst / spänning minskas.
12. Fyll alltid på den fluorescerande provet i vänster sprutan och buffert / törstsläckare i rätt spruta. Se till att grundligt virvel alla prover som innehåller liposomer före lastning, och vara medveten om att LUVS med tiden kommer att bosätta sig i sprutan.

4. Gör ett experiment

1. Bered ett prov av myror-loaded LUVS med antingen lösningsmedel eller förening, och ladda in i spectrofluorometer tillsammans med antingen Na-buffert eller TL-törstsläckare (50 mm TlNO _3, 94 mm NaNO _3, 10 mm HEPES vid pH 7,0).
2. Använd 1,5 ml utspädd ANTS-luv-lösning, med eller utan gramicidin utarbetade föregående dag.
3. Lägg till föreningen på önskad koncentration eller lösningsmedel för kontroller. Håll koncentrationen av lösningsmedelsångor till ett minimum och konstant över alla prover. Halterna kommer att behöva justeras med några nya (okända) förening för att uppnå önskad dos-respons-sortiment. Inkubera i 10 minuter vid 25 ° C i mörker.
4. Vortexa LUV provet och belastning i vänster sprutan. Ladda Na-buffert eller TL-törstsläckare i rätt sprutan.
5. Noggrant ta bort luftbubblor från båda proven genom att trycka sprutor och tillbaka.
6. Se till att båda sprutorna är laddade lika innan du stänger ventilerna. Ojämn belastning kommer att resultera i förskolan blandning av lösningar innan de når inspelningen kammaren.
7. För de allra första provet, registrera fluorescens med Na-buffert, upprepa fyra gånger, justera högspänning (gain) så behövs, och upprepa fem gånger.
8. För de återstående proverna, spela in 9 upprepas med Na-buffert.
9. Byt Na-bufferten med TL-törstsläckare och spela in 13 repriser.
10. Skölj med vatten och fortsätt med nästa prov. Som kontroller använder vi prover med: inget gramicidin och med lösningsmedel, inga gramicidin och med maximal förening koncentration, med både gramicidin och lösningsmedel.

5. Analysera data

1. Överföra resultaten till analysen dator. Läs alla data till MATLAB för analys. För varje prov, läs i alla buffert och upprepar törstsläckare, med undantag för de fyra första i varje enskilt fall, som innehåller blanda artefakter. Förutsatt en enhet volym av 120 mikroliter det tar lite mindre än fyra skott för att helt klara ut den tidigare blandningen från slutade flöde slangar.
2. Bufferten upprepas för samtliga prover bör vara mycket lika. Om det finns ett betydande skifte i fluorescenssignalen, vilket beror på den förening koncentration, då föreningen själv kan lysrör och det kan vara nödvändigt att först dra ifrån denna extra fluorescenssignalen innan normalisera prover.
3. Manuellt gå igenom spår och ta bort "dåliga" upprepar: upprepar innehåller spikar eller avvikelser från flera exponentiality på grund av blandning artefakter och / eller bubblor.
4. Normalisera quencher upprepar att den genomsnittliga startvärdet i bufferten upprepas för varje prov. Kombinera genomsnitt av alla prov i en graf för visualisering.
5. Spår inspelade med ingen gramicidin bör alla vara lika och visar nästan ingen fluorescens släcka, det kan vara en långsam minskning av den fluorescens signalen på grund av långsamma läckage av Tl ⁺ genom blåsor tvåskiktsmembran 8. Om provet utan gramicidin och inga modifierare visar på betydande härdning, då blåsor har försämrats och bör inte användas längre. Om proven utan gramicidin men med modifierare visar betydande härdning, sedan modifierare perturbs blåsorna tvåskiktsmembran i sådan utsträckning att de tillåter att fluoroforen eller törstsläckare att korsa tvåskiktsmembran.
6. Om föreningen ändrar egenskaperna membranet, som kände av gramicidin kanaler, fluorescens tidsförloppet vara synligt ändras.
7. För varje prov, ett utsträckt exponentiell t ex ⁴⁾ är lämplig till den första 2-100 ms av normaliserade fluorescens härdning kurva för de enskilda upprepar och räntan ⁴beräknats till 2 ms. Medelvärden och standardavvikelser är beräknat för en bestämd prov från samtliga enskilda upprepas.
8. Slutligen avgör den relativa förändringen släcka takt genom att normalisera till närmaste referensprovet i tid som har gramicidin och ingen modifierare.

6. Representativa resultat

Figur 1: det väsentliga i fluorescens släcka-baserad analys för att upptäcka förändringar i membranet egenskaper Överst till vänster:. En zooma in på en enda lipid vesikler med myror plus NaNO ₃ på insidan och nano ₃ plus TlNO ₃ på utsidan. Överst till höger: Den fluorescenssignalen in med (blankett topp till botten) ANTS-fyllda vesiklar utan törstsläckare med törstsläckare, med törstsläckare och pre-dopade med 87, 260 och 780 nm gramicidin. Nederst: Schematisk bild av de stoppade-flödet blandningskammare.

Figur 2: En skärmdump från Pro-Data SX programvara som illustrerar de olika panelerna refereras i beskrivningen av experiment.

Figur 3:. Flera upprepa bestämningar av fluorescens signalen från ANTS-loaded LUVS med Na-buffert De första fyra upprepar alltid uteslutas, eftersom de innehåller blandning artefakter. Slangen ansluts provet sprutor till blandning cellen har ett definierat område, alltså de första upprepas kommer att ge oss en läsning av det som tidigare var i slangen: Vatten för upprepning 1 och 2, en kombination av vatten och prov för upprepade 3, mestadels prov för upprepade 4, och bara prov för resterande upprepas.

Figur 4:. Flera upprepa bestämningar av fluorescens signalen från ANTS-loaded LUVS med Na-buffert och med TL-törstsläckare De första fyra upprepar har tagits bort från båda villkoren. Dessutom för TL-törstsläckare mätningar, upprepa 8 måste bort på grund av artefakter, troligen luftbubblor.

. Figur 5: Effekten av capsaicin (Cap) på den tid kursen av myror fluorescens släcka (A) Normaliserad fluorescenssignalen över 1 s, grå prickar beteckna resultat från alla upprepningar (n> 5 per tillstånd), röda linjer betecknar medelvärdet av alla upprepas. (B) De första 100 ms, grå prickar betecknar resultaten från en enda upprepning för varje tillstånd, röda linjer är utsträckta exponentiell passar (2 - 100 ms) för att de upprepas. Den stöpplad blå linje markerar den 2 ms märke, den tidpunkt då andelen släcka bestäms. I både A och B upp spår visar resultat i avsaknad av Tl ^+, de närmaste två spår resultat i avsaknad av GA, med TL ⁺ ± Cap, de fyra lägre spår visas resultat 260 nM GA och Tl ^+, där siffrorna betecknar [Cap] i mikroM. Talen för härdning för 0, 10, 30 och 90 mikroM Cap, som bestäms av graden av en sträckt exponentiell, är 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 och 247 ± 27 (medelvärde ± SD, n> 8) , respektive.

Discussion

Vi har visat en snabb fluorescens-baserad analys för fastställande av tvåskiktsmembran ändra potentialen av droger och andra små biomolekylära. Föreningar som modifierar tvåskiktsmembran egenskaper sannolikt att ändra funktion membranprotein på ett indirekt, ospecifik sätt kan bidra till en "off-target" läkemedelseffekter. Analysen utnyttjar kraften i gramicidin kanaler som sonder för förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter ¹² som kände av tvåskiktsmembran-spänner proteiner. De resultat som erhålls med hjälp av fluorescens-baserad analys stämmer bra med resultat från en kanal gA experiment ^12, vilket indikerar att denna metod kan användas för mekanistiska studier samt för screening förening bibliotek. Använda den nuvarande konfigurationen av analysen kan vi testa dussintals föreningar en dag, vilket är en-till-två tiopotenser högre genomströmning än möjlig med en enda kanal strategi. Det finns inga fundamentala hastighetsbegränsande steg i fluorescens-baserad analys, vilket innebär att den kan utvidgas till att köra i sann high-throughput läge. Det är möjligt att variera analysen är elektrolyt lösningar och / eller använder olika lipid komposition för LUVS ". Det är värt att notera att vissa lipider kompositioner kan skilja när torkade, som kräver snabb lösning utbyte system istället för torkning / vätskebalansen steg ^7.

Det är oklart om det finns ett orsakssamband mellan ökad lipofil droger leder och ökande bortfall i läkemedelsutveckling ^10,11,17 och i så fall, vad är den bakomliggande mekanismen (s)? Trots att membranproteiner tenderar att regleras av förändringar i deras membran miljö ^2, skulle det vara klokt att testa om amfifila läkemedel och leder drogen förändrar relevanta egenskaper membranet och i så fall på vilka koncentrationer? Amphiphile adsorption till membranet kommer bryter vattenfasen, alltså den koncentration som är den fria koncentrationen i vattenfasen som kan vara storleksordningar mindre än den nominella koncentrationen i systemet, t ex ^6,9,16. Om en molekyl önskas (biologiska) effekter förekommer vid koncentrationer där den ändrar tvåskiktsmembran egenskaper, blir det viktigt att skilja mellan "icke-specifika", tvåskiktsmembran-medierad förändringar av membran proteiners funktion, i motsats till direkta effekter på grund av (med hög affinitet ) bindning till en eller flera målproteiner. Veta tvåskiktsmembran-ändra benägenhet av ett läkemedel bly, upptäckt via vanliga high-throughput screening, är därför sannolikt att vara viktig för beslut om dess framtida utveckling.

Alla amphiphile kommer vid en viss koncentration ändra några tvåskiktsmembran egendom. Viktiga överväganden blir därför: Vid vilken koncentration, och är de förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter kände av (tvåskiktsmembran-spänner) membranproteiner? Här kan vi utnyttja de möjligheter gramicidin att bilda kanaler genom transbilayer dimerization ^15. Det gör dem användbara prober för den energiska kopplingen mellan lipid bilayers och tvåskiktsmembran-inbäddade proteiner och för att utforska om små molekyler ändra tvåskiktsmembran egenskaper som kände av membranproteiner. Analysen är snabb, pålitlig och skalbar, och därför passar både biofysiska studier och för screening förening bibliotek för läkemedel med potential tvåskiktsmembran-störande effekter.

För ytterligare information om analysen, kontroll av analysen effektivitet, och jämförelser med en kanal elektrofysiologi se ^12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidin	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Mini-Extruder kit	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 Desalting column	Sigma-Aldrich	54805