单细胞转染鸡胚

Summary

使用精尖微量注入鸡体节或神经管的子域的质粒DNA。质粒的浓度调整，以产生单一的转染细胞。然后，我们允许的细胞发育成无性系种群。

Abstract

发育生物学的一个中心主题是多样化的谱系和澄清的分子机制。这需要一个正常和实验条件下的单细胞的命运的透彻分析。为此，目标单祖细胞的转染方法，是一个先决条件。我们在这里介绍一个简单的方法转染在OVO鸡组织中单个细胞，让可靠的谱系跟踪以及遗传操作技术。体节或神经管内，是针对特定的组织域的DNA直接注入利益的上皮细胞，导致零星的单细胞转染。记者，无性系种群可能因此被追踪长达三天，并与对照相比，无性系种群的基因操纵行为可以。此方法利用鸡胚无障碍的优势，以及与新兴的基因操纵的工具。我们比较，并讨论其优点被广泛使用的电击方法，以及可能的应用，还建议使用额外的体内模型。我们提倡使用这种方法的重要补充和补充现有的谱系追踪和基因干扰工具。

Protocol

1。准备的微量移液器

我们Narishige PP - 83标准的吸管拉马拉我们的吸液管与热定型为13.5。精确的设置必须校准，目的是在枪头直径8至10微米。我们使用长丝含有硼硅玻璃管，外径1.0毫米，内径0.75-0.78毫米。移液器因此存储在一个塑料菜与菜的边缘接触保护提示。

2。 DNA的制备

利益的质粒转染到大肠杆菌DH5α中使用标准程序的大肠杆菌。从单菌落过夜培养用于纯化质粒最大制备试剂盒（应该做的任何商业套件）。我们使用质粒浓度为1.0微克/μL非克隆注射。高浓度的增加枪头堵塞。对于克隆的应用，质粒浓度要低得多，必须进行调整（见下文）。对于pCAGG - GFP，生产克隆成果的最佳浓度被发现约0.05-0.1微克/μL。 1 - 2μL的质粒通常用于每个实验，在实验开始前，添加少量的快速绿色粉末（坚持干尖，锋利的玻璃吸管）质粒。质粒是在台式离心机最大速度为2分钟离心。这个过程似乎减少吸管堵塞问题。

3。注射胚胎

3.1胚胎的制备

我们使用注射鹌鹑，以及鸡蛋。卵孵化躺在其长轴上，直到所需的发育阶段。鸡蛋是用70％乙醇擦洗，并让其干燥。鸡蛋指出到底是刺穿手术剪（这是必要的，只有在鸡蛋）和1毫升（鹌鹑）或2毫升蛋白（鸡）是一个10毫升的注射器（19G针）从鸡蛋绘制。该洞，然后用热石蜡密封。

实际注射前，打开一个窗口，在鸡蛋壳，用手术剪顶部。配售的超额壳胶带切割，并通过它可以帮助减少从壳碎片。含有抗生素的PBS缓冲液，吸管立即进入卵子。要访问的胚胎，卵黄和/或羊水膜切割和挪用使用0.14毫米的昆虫装到一个持针器引脚。无毒的墨水（鹈鹕＃17）是注入帮助可视化胚胎的胚盘底，用火，拉毛细管装在一个抽吸。

3.2加载和安装的微量

拉马微量可装载与质粒拉火毛细血管足够的直径，装到一个抽吸。少量的质粒绘制到开幕相反的吸管，以削尖的提示使用毛细管和加载，并尽可能接近由内而外的一角。因此移液器装上手动的空气压力，喷油器上安装一个显微。施加最小的压力，如果必要的话，为了让质粒的解决方案，以达到吸管尖。

3.3质粒注射

吸管是操纵鸡蛋的液体介质，同时运用一些空气压力，以防止吸头堵塞。有关组织域刺穿。压力变化的提示进入组织往往是足够的释放与可见的快速绿色质粒。如果是这样的情况下，适用于轻微的压力注射器，直到弹出质粒/快绿。这个过程可以反复沿轴的胚胎，例如在相邻的体节，或沿神经管的程度。注射之后，PBS可能会增加。窗口是用胶带密封（封口膜是不可取的，特别是鹌鹑蛋，它会增加胚胎死亡率，可能阻止通过外壳的氧气交换）。返回到处理的胚胎孵化器。避免通风，并放置在孵化器中的水的小容器，因为它们有助于保持水分和增加产量。

4。调整注入参数和监测成功率

Asessing和校准各种注塑参数是瞄准单细胞分析应用的关键。每次注射的事件会导致一个单细胞的成功标签。质粒浓度过高会导致非克隆的标签，而高失败率非常低的浓度结果。克隆注射注入质粒的浓度必须优化。我们建议整个纯化质粒股票的稀释，而不是预先确定的浓度稀释个人PREPS。后者可能会引入一些成功率，可能是由于在纯度上的差别，以及其他参数，如超螺旋质粒的比例差异。

4.1评估整装观测的成功率

整体式观察，可以执行注射胚胎的初步评估，根据荧光的双眼。注射后6至8小时充足的评估与pCAGG增强型绿色荧光蛋白构建成功率。这是提供目标网站是肤浅的不够是显而易见的（如体节的背，背神经管，外胚层等，见图1A - C）。这一步是特别有助于评价实验系列参展要么太多标记的细胞，或者没有任何荧光细胞。如果需要进一步孵化，含抗生素的PBS液中应加入鸡蛋后查看密封胶条应更换。

4.2串行节的分析评估克隆

评估注射成功率的最佳手段是通过连续切片注入胚胎，采用免疫组织化学可视化的标记细胞。在这些条件下，孵化时间短，如注射后4小时。胚胎是固定的，石蜡切片（或cryosectioning）处理。玻璃安装部分，然后去paraffinized记者可视化免疫染色。如生物素 - 亲和扩增方法可能是可取的。最后，连续切片扫描检测注入段标记的细胞。如果经初步试验，而不是单个细胞的多个获得，必须稀释质粒股票和反复的过程，直到达到足够的结果。成功率过高的情况下，可能需要2至10倍的质粒原液稀释。

对于每个质粒转染，彻底的校准，以确保克隆应该被重复。

5。代表性的成果

我们通常开展pCAGG - GFP每体节的单次注射，同时针对每^胚胎1 2 6-12段。此设置下，一个明确的信号，可以检测到整个装载观察8小时注射后，至少在一个段的十一个胚胎。在这些条件下，标签，进一步证实被克隆（图1B，C）。最胚胎使用DNA浓度高时，可能会出现至少有一个成功的注入，提高了多个单元格已转的可能性。

部分序列分析表明，克隆转染成功率达到10％左右。这意味着，以实现克隆，技术是每个定义，效率非常低。另一方面，在这些条件下，超过93％的正面标签事件被发现被克隆^1。

图1。克隆到神经和骨骼祖细胞注射的pCAGGS - GFP（AC）显示背神经管（新台币）的标签（一），dermomyotome（DM）（二）腹外域，或中央的DM表（三）横截面，pCAGGS - GFP的显微注射到一个祖后6小时。 （四）中央DM产生在两个真皮（四），以及肌肉（M）（见文献¹的细节）的衍生物，单祖细胞克隆转染后的两天。

Discussion

上面介绍的方法是修改为先前所描述的技术，提供亲脂性染料的小细胞亚^群或3个单祖。它有三个以上的标准电技术的主要优势。首先，它提供了一个标签在靶组织中的信心离散网站的手段，让远远大于电空间分辨率（例如图1B，C）。其次，它允许单一细胞的标签，从而使跟踪的血统^，另有 1 2（图1C，D） ​​的正常条件下在体内。三，基因表达怀念在单细胞水平宗族隔离，调查研究在其他正常的背景下的生长因子或细胞行为上的其他基因的作用的分子机制提供了一个工具等，因此，这种方法的补充广泛应用于电技术，并进一步利用的空间-时间调节增益和体内基因功能丧失的禽流胚胎的机会。

一个日益相关的应用程序是使用新兴的^{实时成像技术4} 5 6 7在单细胞水平（细胞的迁移，轴突的指导下，细胞分裂等）的细胞行为的分析。在这些实验的一些设置，它可能是最好使用一个快速激活记者物种（如金星^GFP）8，以允许可视化注入细胞的早期。

由于这里描述的方法简单，很可能，它也可以适用于其他动物，如斑马鱼和爪蟾模型。该系统是很容易设置和使用，和主要的困难是产生足够大的一系列标记的胚胎，以及扫描标记在后代的需要串行节的应用。在我们手中，注射的细胞表现出一个不易察觉的长达3天的GFP信号，但此参数是可能依赖于细胞的增殖率。使用长寿命，如LAC - Z的记者，或转座子介导的基因转移，导致稳定^整合 9，有可能延长子代的跟踪。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B