תא יחיד transfection בעוברים צ'יק

Summary

באמצעות קצה בסדר micropipettes אנו מזריקים פלסמיד דנ"א לתוך תחומי משנה של somites עוף או צינורות עצביים. ריכוז של פלסמיד מותאם לייצר תאים transfected יחיד. לאחר מכן, אנו מאפשרים לתאים להתפתח אוכלוסיות משובט.

Abstract

נושא מרכזי בביולוגיה התפתחותית היא גיוון של שושלות ועל הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס. זה כרוך ניתוח מעמיק של גורלם של תאים בודדים בתנאים נורמליים וניסיוני. לשם כך, שיטות transfection כי היעד אבות חד הם תנאי מוקדם. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה מבחינה טכנית עבור transfecting תאים בודדים ברקמות עוף, אובו, המאפשר מעקב אחר השושלת אמין כמו גם מניפולציה גנטית. תחומים ספציפיים ברקמות ממוקדות בתוך somite או בצינור העצבי, ו-DNA מוזרק ישירות לתוך האפיתל של עניין, וכתוצאה מכך transfection סדירה של תאים בודדים. באמצעות כתבים, אוכלוסיות המשובטים וכתוצאה מכך עלול לייחס לתקופה של עד שלושה ימים, התנהגות של אוכלוסיות המשובטים מניפולציות גנטיות ניתן להשוות עם זה של הביקורת. שיטה זו מנצלת את הנגישות של העובר חומוס יחד עם כלים חדשים עבור מניפולציה גנטית. אנו משווים ולדון יתרונות על פני שיטת בשימוש נרחב electroporation, יישומים אפשריים לשימוש ב-vivo מודלים נוספים הציעו גם הם. אנחנו תומכים את השימוש בשיטה זו כתוספת משלימים משמעותי על השושלת התחקות קיימים כלי התערבות גנטית.

Protocol

1. הכנת micropipettes

אנו למשוך pipettes שלנו על Narishige תקן PP-83 פיפטה חולץ עם הגדרת החום של 13.5. ההגדרה המדויקת חייב להיות מכויל, מכוון בקוטר טיפ פיפטה של ​​בין 8 ל 10 מיקרון. אנו משתמשים חוט המכילים צינורות זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.0 מ"מ בקוטר הפנימי של 0.75-0.78 מ"מ. Pipettes מאוחסנים ולכן בצלחת פלסטיק בקצות מוגן מפני מגע עם הקצוות של המנה.

2. ה-DNA הכנה

פלסמיד של הריבית transfected לתוך DH5α E. coli באמצעות נהלים סטנדרטיים. תרבויות לינה ממושבות יחיד משמשים לטהר את הפלסמיד באמצעות maxi-מכין ערכות (כל ערכה המסחרי צריך לעשות). אנו משתמשים ריכוז הפלסמיד של 1.0 מיקרוגרם / μL שאינם משובטים זריקות. ריכוזים גבוהים יותר להגדיל את סתימת טיפים פיפטה. עבור יישומים המשובטים, ריכוזי פלסמיד הם הרבה יותר נמוך חייב להיות מותאם (ראו להלן). עבור pCAGG-GFP, ריכוז אופטימלי לייצור תוצאות המשובטים נמצאה על 0.05-0.1 מיקרוגרם / μL. אחת ל 2 μL של פלסמיד משמש בדרך כלל לכל הניסוי, כמות מזערית של אבקת מהיר ירוק (שמירה על קצה פיפטה יבשה זכוכית חדים) מתווסף הפלסמיד לפני שהניסוי יתחיל. הפלסמיד הוא centrifuged אז בצנטריפוגה השולחן במשך 2 דקות במהירות מקסימלית. הליך זה נראה להפחית פיפטה, סתימת בעיות.

3. הזרקה של עוברים

3.1 הכנת עוברים

אנו משתמשים שליו כמו גם ביצי תרנגולת זריקות. הביצים מודגרות שוכב על ציר ארוך שלהם עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. הביצים ניקה עם 70% אתנול ו להתייבש. בסוף הצביעה של הביצה הוא דקר במספריים כירורגית (זה הכרחי רק ביצי תרנגולת) ו 1 מ"ל (ב שלווים) או 2 מ"ל (חומוס) של חלבון הוא נמשך מן הביצה עם מזרק מ"ל 10 (19G מחט). החורים סגורים אז עם פרפין חם.

לפני ההזרקה בפועל, חלון נפתח בחלק העליון של קליפת הביצה באמצעות מספריים כירורגיות. הנחת סרט דביק על הקליפה חיתוך דרך זה יכול לעזור להפחית את הפסולת מן הקליפה. חיץ PBS המכיל אנטיביוטיקה היא pipetted מיד לתוך הביצה. כדי לגשת את העובר ואת vitelline / או קרומי מי השפיר הם לגזור הוסט באמצעות סיכות חרקים 0.14 מ"מ מותקן על גבי מחזיק מחט. אינו רעיל דיו (שקנאי # 17) מוזרק מתחת blastoderm כדי לעזור להמחיש את העובר, באמצעות אש משך נימי רכוב על aspirator.

3.2 טוען ואת הרכבה של micropipettes

Micropipettes חולץ ניתן לטעון עם הפלסמיד על ידי אש משך נימים בקוטר נאותה, רכוב על גבי aspirator. כמות מינימלית של פלסמיד נשאבים באמצעות נימי וטעון פיפטה ממול פתיחתו ועד קצה מחודד, והוא מתקרב קצה מבפנים כמה שיותר. פיפטה נטען וכתוצאה מכך על לחץ אוויר ידני מזרק רכוב על micromanipulator. לחץ מינימלי מוחלת, במידת הצורך, כדי לאפשר את פתרון פלסמיד להגיע אל קצה פיפטה.

3.3 הזרקת פלסמיד

פיפטה היא מניפולציה לתוך המדיום הנוזלי של הביצה תוך יישום כמה לחץ אוויר כדי למנוע סתימת של קצה פיפטה. תחום הרקמה הרלוונטית היא פירסינג. השינוי בלחץ כמו קצה נכנס רקמה היא לעתים קרובות מספיק כדי לשחרר את הפלסמיד עם ירוק מהיר גלוי. אם זה לא המקרה, להפעיל לחץ קל על המזרק עד ירוק פלסמיד / מהר נפלטים. תהליך זה ניתן לחזור לאורך ציר של העובר, למשל somites הסמוך או לאורך היקף הצינור העצבי. בעקבות זריקות, PBS ניתן להוסיף. החלון אטום באמצעות סרט דביק (parafilm אינו רצוי במיוחד עבור שליו ביצים, הוא מגביר את שיעורי המוות העובר, ככל הנראה על ידי חסימת החליפין של חמצן דרך הקליפה). עוברים טיפול מוחזרים באינקובטור. הימנע אוורור המקום מכולות קטן עם מים בחממה כפי שהם מסייעים לשמור על התשואות לחות להגדיל.

4. התאמת פרמטרים הזרקת ניטור שיעורי ההצלחה

Asessing ו כיול פרמטרים שונים זריקה קריטית עבור יישומים מכוון ניתוח מתא בודד. לא כל אירוע זריקת תוביל תיוג מוצלח של תא בודד. ריכוז פלסמיד אשר גבוה מדי עלול להוביל תיוג לא משובטים, בעוד ריכוזים נמוכים מאוד עקב שיעורי כישלון גבוהים. ריכוז של פלסמיד שהוחדר חייב להיות מותאם זריקות משובט. אנו ממליצים על דילול המניות כולו פלסמיד מטוהרים ולא דילול preps הפרט הריכוז שנקבע מראש. האחרוניםאולי להכניס קצת שונות של אחוזי ההצלחה, ככל הנראה בשל שינויים טוהר ופרמטרים נוספים כגון שיעור פלסמיד supercoiled.

4.1 הערכת שיעורי ההצלחה על ידי תצפית הר שלם

הערכה ראשונית של עוברים מוזרק יכול להתבצע על ידי כל תצפית הר המשקפת תחת ניאון. שש עד שמונה שעות לאחר הזרקת מספיקים כדי להעריך את שיעורי ההצלחה עם לבנות pCAGG משופרת GFP. זה סיפק את אתר היעד היא שטחית מספיק כדי להיות ברורה ממבט ראשון (למשל somite הגבי, בצינור העצבי הגבי, וכו 'האאקטודרם, ראה איור 1A-C.). צעד זה שימושי במיוחד להערכת סדרת ניסויי בתערוכה או תאים שכותרתו יותר מדי או לחילופין, חסר כל התאים ניאון. אם הדגירה נוסף הוא הרצוי, אנטיביוטיקה המכילים פתרון PBS יש להוסיף את הביצה לאחר צפייה בקלטת איטום צריך להיות מוחלף.

4.2 clonality הערכת ידי ניתוח סדרתי, בסעיף

האמצעי הטוב ביותר להערכת שיעורי זריקות מוצלחת היא סדרתי, חתך עוברים מוזרק באמצעות אימונוהיסטוכימיה לדמיין את התאים שכותרתו. בתנאים אלה, פעמים הדגירה יכול להיות קצר ככל 4 שעות לאחר ההזרקה. עוברים קבועים ומעובדים עבור חתך פרפין (או cryosectioning). זכוכית רכוב חלקים אז הם דה paraffinized ו חיסונית מוכתם להדמיה הכתב. שיטות הגברה כגון ביוטין, streptavidin עשויה להיות רצויה. לבסוף, סעיפים הסידורי נסרקים לגילוי תאים שכותרתו במגזרי מוזרק. אם על הניסויים הראשוניים מרובים יותר מאשר תאים בודדים מתקבלים, המניה פלסמיד חייב להיות מדולל והתהליך חוזר על עצמו עד תוצאות נאות מושגות. שני עד פי 10 דילולים של הפתרון מניות פלסמיד עשוי להיות נחוץ במקרים של שיעורי ההצלחה להיות גבוה מדי.

עבור כל פלסמיד להיות transfected, כיול יסודית שתבטיח clonality יש לחזור.

5. נציג תוצאות

אנחנו בדרך כלל לבצע הזרקה בודדת של pCAGG-GFP לכל somite, תוך מיקוד קטעים 6-12 לכל העובר ^{1 2.} תחת הגדרה זו, אות ברור יכולים להתגלות כל הר 8 זריקה תצפית שלאחר שעות, בקטע אחד לפחות של עובר אחד מתוך עשרה. בתנאים אלה, תיוג אושרה עוד להיות משובט (איור 1 ב ', ג'). בעת שימוש בריכוזים גבוהים DNA, רוב העוברים עשוי להפגין לפחות זריקה אחת מוצלחת, מעלים את האפשרות כי מספר תאים כבר transfected.

ניתוח סעיף סידורי גילה כי transfections המשובטים הושגו כאשר שיעור ההצלחה היה 10%. משמעות הדבר היא כי על מנת להשיג clonality, הטכניקה היא לפי הגדרה, לא יעיל במיוחד. מצד שני, בתנאים אלה, יותר מ 93% של אירועים תיוג חיובי נמצאו ¹ משובט.

באיור 1. זריקות המשובטים של pCAGGS-GFP לתוך אבות עצביים השלד. (AC) סעיפים רוחבי מראה תיוג של הצינור העצבי הגבי (NT) (א), תחום ventrolateral של dermomyotome (DM) (ב), או גיליון DM מרכזי (C) , 6hr לאחר microinjection של pCAGGS-GFP על אב אחד. (ד) יומיים לאחר transfection המשובטים של המרכזי, אבות DM יחיד שנוצר נגזרים בדרמיס שני (ד '), כמו גם שרירים (M) (ראו נ"צ. ¹ לפרטים נוספים).

Discussion

השיטה המתוארת לעיל הוא שינוי של טכניקה שתואר לעיל עבור אספקת צבעים lipophilic אל תת תאים קטנים או אבות חד ^3. יש שלושה יתרונות עיקריים על הטכניקה electroporation סטנדרטי. ראשית, הוא מספק אמצעי עם תיוג אתרים ביטחון דיסקרטית ברקמות היעד, ומאפשר ברזולוציה מרחבית הרבה יותר מאשר electroporation (ראו איור 1B לדוגמה, C). שנית, הוא מאפשר תיוג של תאים בודדים, ובכך מאפשר להתחקות אחר שושלת היוחסין שלהם ב-vivo אחרת תחת תנאים נורמליים ^{1 2} (איור 1 ג, ד). שלישית, גן להחמיץ ביטוי ברמה מתא בודד מספק כלי לחקר המנגנונים המולקולריים של הפרדה השושלת, ללמוד את התפקיד של גורמי גדילה או של גנים אחרים על התנהגות הסלולר ברקע נורמלית אחרת, וכו 'לכן, שיטה זו משלימה הטכניקה electroporation מיושמים באופן נרחב, ועוד מנצל את הנגישות של העובר העופות כדי לזכות-spatio temporally מוסדר אובדן תפקוד הגן ב-vivo.

יישום רלוונטי יותר ויותר היא ניתוח של התנהגויות הסלולר ברמת תא בודד (נדידת תאים, הדרכה axonal, חלוקת התא וכו ') באמצעות טכנולוגיות הדמיה המתעוררים לחיות ^{4 5 6 7.} בחלק מן ההגדרות האלה ניסיוני, זה יכול להיות רצוי להשתמש מהירה הפעלה מינים הכתב (כגון ונוס-GFP) ⁸ על מנת לאפשר ראיה קודמות של התא שהוחדר.

לנוכח הפשטות של השיטה המתוארת כאן, סביר מאוד שזה יכול להיות מיושם גם בבעלי חיים אחרים, כגון דג הזברה Xenopus. המערכת היא קלה מאוד להתקנה ולשימוש, והקושי העיקרי הוא לייצר סדרה מספיק גדול של עוברים שכותרתו, כמו גם סריקה עבור הצאצאים שכותרתו ביישומים הדורשים סדרתי, קטעים. בידיים שלנו, התאים מוזרקים הציג אות ה-GFP לזיהוי בקלות עד 3 ימים, אך פרמטר זה עשוי להיות תלוי שיעורי התפשטות תאים. באמצעות כתב חיים ארוכים כמו לאק-Z, או transposon בתיווך העברת גנים המובילים שילוב יציב ^9, אפשר יהיה להאריך מעקב של הצאצאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B