Summary
좋은 팁을 사용하면 우리가 닭 somites이나 신경 튜브의 하위 도메인에 플라스미드 DNA를 주입 micropipettes. 플라스미드의 농도는 단일 transfected 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 우리는 다음 세포가 clonal 인구로 발전 수 있습니다.
Abstract
발달 생물학의 중심 주제는 lineages의 다변화 및 기본 분자 메커니즘의 해설입니다. 이것은 정상 및 실험 조건에서 단일 세포의 운명의 철저한 분석을 알아볼 수 있습니다. 이를 위해 하나의 progenitors를 대상으로 transfection 방법은 꼭 필요합니다. 우리는 여기에 유전자 조작뿐만 아니라 신뢰할 수있는 추적 혈통, - 비켜에서 닭 조직에서 단일 세포를 transfecting 수를위한 기술적 간단한 방법을 설명합니다. 특정 조직 도메인은 체절 또는 신경 튜브 내에 타겟으로하고 있으며, DNA가 단일 세포의 산발적 transfection 그 결과, 관심의 상피에 직접 주입합니다. 기자를 사용 clonal 인구는 따라서 3 일이에 추적될 수 있으며, 유전자 조작 clonal 인구의 동작은 컨트롤의와 비교할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 조작을위한 새로운 도구와 함께 여자는 배아의 접근을 활용합니다. 우리는 비교하고 널리 사용되는 electroporation 방법을 통해 장점과 가능한 응용 프로그램을 토론하고 또한 제안 추가에서 - 생체내 모델에 사용합니다. 우리는 기존의 혈통 추적 및 유전자 간섭 도구 상당한 또한 및 보완이 방법의 사용을 옹호.
Protocol
1. Micropipettes의 준비
우리는 13.5의 열 설정을 표준 Narishige PP - 83 피펫 끌어당기는에 우리 pipettes를 가져옵니다. 정확한 설정은 8시 사이에 10 미크론의 피펫 팁의 직경을 목표로, 보정해야합니다. 우리는 필라멘트 함유 1.0 mm와 0.75-0.78 mm의 내경의 외부 직경 borosilicate 유리 튜브를 사용합니다. pipettes은 결과적으로 접시의 가장자리에 접촉으로부터 보호 도움말과 플라스틱 그릇에 저장됩니다.
2. DNA 준비
관심 플라스미드는 DH5α E.으로 transfected 있습니다 표준 절차를 사용하여 대장균. 하나의 식민지에서 숙박 문화는 플라스미드를 사용 맥시 - 준비 키트 (상업적 키트해야) 정화하는 데 사용됩니다. 우리는 1.0의 플라스미드 농도 비 clonal 주사에 대한 μg / μL를 사용합니다. 높은 농도는 피펫 팁의 막히는을 향상시킬 수 있습니다. clonal 어플 리케이션의 경우, 플라스미드 농도는 훨씬 낮은 있으며 (아래 참조) 조정해야합니다. pCAGG - GFP 들어, clonal 결과를 생산 최적의 농도는 약 0.05-0.1 μg / μL로 발견되었습니다. 플라스미드 중 하나 2 μL는 일반적으로 실험마다 사용되며, 실험이 시작되기 전에 빨리 녹색 분말의 최소 금액 (건조하고 날카로운 유리 피펫의 팁을에 준수) 플라스미드에 추가됩니다. 플라스미드는 다음 최대한의 속도로 2 분 탁상 원심 분리기에 centrifuged 있습니다. 이 절차는 피펫 - 막히는 문제를 줄일 것으로 보인다.
3. 태아의 분사
배아 3.1 준비
우리는 주사에 대한 퀘일뿐만 아니라 닭고기 계란을 사용합니다. 달걀은 원하는 발달 단계까지 자신의 긴 축 위에 누워 incubated 수 있습니다. 달걀은 70 % 에탄올로 채취하고 건조 사용할 수 있습니다. 계란의 지적 끝 외과 가위 (이 밖에 닭고기 계란에 필요합니다) 1 ML (퀘일즈) 또는 10 ML 주사기 (19G 바늘)와 난자에서 그림이 그려진 횐자위 2 ML (여자)와 피어싱입니다. 구멍 그런 다음 따뜻한 파라핀과 함께 봉인하고 있습니다.
실제 주입하기 전에, 창이 수술 가위를 이용하여 알 껍질의 상단에 열립니다. 쉘을 통해 끈끈한 테이프를 배치하고 그것을 통해 절단하면 껍질에서 파편을 줄일 수 있습니다. 항생제를 포함하는 PBS 버퍼는 계란으로 즉시 pipetted입니다. 배아에 액세스하려면 vitelline 및 / 또는 amniotic 점막에 상처가 있으며 바늘 홀더에 장착된 0.14 mm 곤충 핀을 사용하여 전환. 무독성 잉크가 (펠리칸 # 17)를 사용, 배아를 시각화에 도움이되는 배반엽 아래 주입하는 흡인기에 탑재된 모세 화재를 뽑아.
3.2 micropipettes의 로딩과 장착
풀러 micropipettes은 흡인기에 탑재, 적절한 직경의 불꽃 뽑아 모세 혈관에 의해 플라스미드로 로드할 수 있습니다. 플라스미드의 최소 금액은 날카롭게 팁하기 위해 개방 반대에서 피펫으로 모세관과로드를 사용하고, 가능한 한 내부에서 팁을 접근 그려진 것입니다. 피펫은 따라서 인젝터가 micromanipulator에 탑재된 수동 공기 압력에로드됩니다. 최소 압력은 플라스미드 솔루션 피펫의 끝에 도달 수 있도록, 필요한 경우 적용됩니다.
3.3 플라스미드 주입
피펫 팁의 막히는 것을 방지하기 위해 공기 압력을 적용하는 동안 피펫은 계란의 액체 매체로 조작할 수 있습니다. 관련 조직 도메인에 피어싱입니다. 팁이 조직을 입력으로 압력의 변화는 종종 눈에 보이는 빠른 그린과 플라스미드 릴리스 충분하다. 이 경우가 아니라면 빠른 / 플라스미드 녹색이 나옵 때까지, 주사기에 약간의 압력을 적용합니다. 이 과정은 인접 somites 예를 또는 신경 튜브의 정도 함께 배아의 축을 따라 반복 수 있습니다. 주사 후, PBS를 추가할 수 있습니다. 창이 (parafilm 특히 퀘일에 대해 바람직하지 않습니다 계란 - 그것은 껍질을 통해 산소의 교환을 차단하여 아마도 배아 사망 속도 증가) 끈적끈적한 테이프를 사용하여 밀폐 있습니다. 치료 배아는 인큐베이터에 반환됩니다. 통풍을 피하십시오 그들이 수분과 증가 수확량을 유지로 인큐베이터에서 물을 작은 용기를 놓습니다.
4. 사출 매개 변수를 조정하고 성공 요금 모니터링
Asessing 다양한 사출 매개 변수를 보정하면 단일 세포 분석을 목표로 응용 프로그램에 중요합니다. 하지 않는 분사 이벤트는 단일 세포의 성공적인 레이블로 이어질 것입니다. 높은 장애 율이 매우 낮은 농도 결과를하면서 너무 높은 농도는 플라스미드가 아닌 clonal 라벨을 초래할 수 있습니다. 주입 플라스미드의 농도가 clonal 주사에 최적화된해야합니다. 우리는 미리 정해진 농도 개별 preps을 diluting보다는 전체를 정화 플라스미드 주식 희석하는 것이 좋습니다. 후자의순도의 변화와 같은 supercoiled 플라스미드의 비율과 같은 다른 매개 변수에 의한 아마도 성공 요금의 몇 가지 변화를 소개 수도 있습니다.
전체 마운트 관찰에 의해 평가 4.1 성공 요금
주입된 배아의 초기 평가는 형광등 아래에 전체 쌍안경 마운트 관찰하여 수행할 수 있습니다. 여섯 시간에서 여덟 시간 후 주사 pCAGG 향상된 GFP 구조와 성공 속도를 평가하기에 충분합니다. 이것은 대상 사이트 (예 등의 체절, 등의 신경 튜브, ectoderm 등은 그림 1A - C를 참조하십시오.) 쉽게 나타나지 정도로 표면입니다 제공됩니다. 이 단계는 너무 많은 레이블 셀 또는 다른 방법으로, 어떤 형광 세포를 부족 중 하나를 전시 실험 일련의 평가 특히 도움이됩니다. 추가 부화가 원하는 경우, 항생제 함유 PBS 솔루션은보고 후 계란에 추가되어야하며 씰링 테이프 교체해야합니다.
시리얼 - 섹션 분석하여 4.2 평가 clonality
성공적인 주사의 속도를 평가하기위한 가장 좋은 수단은 주입된 배아를 순차적 - sectioning와 라벨 세포를 시각화하는 immunohistochemistry를 사용하는 것입니다. 이러한 조건에서 배양 시간 4 시간 후 주사처럼 짧은 수 있습니다. 배아는 고정과 파라핀의 sectioning (또는 cryosectioning)에 대한 처리됩니다. 유리 장착 섹션 다음 드 paraffinized과 기자의 시각화를위한 단백질 묻은 있습니다. 이러한 비오틴 - streptavidin과 같은 증폭 방법은 바람직하지 수 있습니다. 마지막으로, 시리얼 섹션은 주입 세그먼트에 표시 세포를 감지하기 위해 스캔됩니다. 오히려 하나의 세포보다 여러가를 얻을 수있다 초기 실험에 따라면, 플라스미드 주식은 희석해야하며 충분한 결과를 얻을 때까지 프로세스를 반복했다. 플라스미드 주식 솔루션의 두 10 배 dilutions가 너무 높습되고 성공적인 요금의 경우에 필요할 수 있습니다.
각각의 플라스미드가 transfected하기 위해서는, clonality를 보장합니다 철저한 교정을 반복해야합니다.
5. 대표 결과
태아 1 2 당 6-12 세그먼트를 타겟으로하는 우리는 일반적으로 체절마다 pCAGG - GFP의 단일 주사를 수행합니다. 이 설정에서 확실한 신호는 열명 중에 한분 배아 중 하나 이상 구간에서 전체 마운트 관찰 8 시간 게시 주입에 의해 감지하실 수 있습니다. 이러한 조건에서 라벨이 추가 (그림 1B, C) clonal으로 확인되었다. 높은 DNA의 농도를 사용할 때, 대부분의 태아는 여러 세포 transfected되었다는 가능성을 높이는, 적어도 하나의 성공적인 주사를 발생할 수 있습니다.
시리얼 섹션 분석 성공률이 10 % 정도되었을 때 clonal transfections가 달성되었다 것으로 나타났다. 이것은 clonality를 달성하기 위해, 기법, 정의 당 매우 비효율적임을 의미합니다. 반면에, 이러한 조건에서 긍정적인 라벨링 이벤트 이상의 93%는 clonal 한 것으로 밝혀졌다.
그림 1. 신경 및 골격 progenitors에 pCAGGS - GFP의 Clonal 주사. 지느러미 신경 튜브 라벨 (NT) (A), dermomyotome (DM) (B)의 ventrolateral 도메인 또는 중앙 DM 시트 (C)를 표시 (AC) 가로 섹션 , 단일 시조로 pCAGGS - GFP의 microinjection 후 6hr. (D) 진피 (D)뿐만 아니라 근육 (M) (심판을 참조하십시오. 자세한 내용은 1) 모두에서 파생을 생성한 중앙 DM, 단일 progenitors의 clonal transfection 다음 두 가지 일.
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Discussion
위에서 설명한 방법은 작은 세포 하위 집합 또는 단일 progenitors 3 lipophilic 염료를 전달하기위한 이전에 설명한 기법의 수정입니다. 이것은 표준 electroporation 기법을 통해 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, electroporation보다 훨씬 큰 공간 해상도 (C, 예를 들어 그림 1B에 대한 참조) 허용, 대상 조직에 대한 신뢰 개별 사이트로 라벨을위한 수단을 제공합니다. 둘째, 따라서 달리 정상적인 조건 1 2 (그림 1C, D)에 따라 - 생체내들의 혈통을 추적할 수 있도록, 단일 세포의 라벨링 수 있습니다. 셋째, 단일 세포 수준에서 유전자 미스 표현은 달리 정상을 배경으로 성장 요인이나 세포 행동에 다른 유전자의 역할을 공부에 대한 가계의 분리의 분자 메커니즘을 조사하기위한 도구를 제공, 등 그러므로,이 방법 보완 널리 적용 electroporation 기법, 그리고 더 이상은 spatio - temporally 규제 이득 및 유전자 기능에 - 생체내 손실 조류 배아의 접근을 이용.
점점 관련 응용 프로그램은 신흥 라이브 영상 기술 4 5 6 7을 사용하여 단일 세포 레벨 (셀 마이 그 레이션, axonal지도, 세포 분열 등)에서 세포 행동의 분석이다. 이러한 실험 설정의 일부에서는, 그것은 주입된 세포의 이전 시각화 수 있도록 빠른 정품 인증 기자 종 (예 : 비너스 - GFP 등) 8 순서를 사용하는 것이 바람직하다 수 있습니다.
여기에서 설명한 방법의 단순 감안할 때, 그것이 같은 Zebrafish 및 Xenopus 같은 다른 동물 모델에도 적용될 수 있다고 가능성이 높습니다. 시스템 설정 및 사용하기 매우 쉽습니다, 그리고 주요 어려움이 표시된 배아의 충분히 큰 일련의 생성뿐만 아니라 직렬 섹션을 요구하는 어플 리케이션에 표시 자손을 스캔합니다. 우리 손에, 주입 전지는 최대 3 일 동안 쉽게 감지 GFP 신호를 전시하지만,이 매개 변수는 세포 증식의 속도에 따라 가능성이 높습니다. 등 락 - Z와 같은 긴 기자, 또는 안정적인 통합 9 최고의 transposon - 매개 유전자 전달을 사용하여, 그것은 자손의 추적 연장 가능 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 신경 튜브 이미지 Shlomi Krispin 감사합니다. 특히, 우리는 GFP의 transfection 기술을 시작을위한 Yuval 계피를 인정합니다. 이 작품은 CK하는 이스라엘 과학 재단, 협회 테크 프랑세즈 contre 레 Myopathies하고, 도이치의 Forschungsgemeinshaft, 공동 연구 센터 488에서 보조금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette tubes | Sutter Instrument Co. | B100-75-10 | |
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | |
| Insect needles | Watkins Doncaster | E6871 | |
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
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