Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

Summary

Mit feiner Spitze Mikropipetten spritzen wir Plasmid-DNA in Subdomains Huhn Somiten oder neuronale Röhren. Die Konzentration der Plasmid wird angepasst, um einzelne transfizierten Zellen zu generieren. Dann erlauben wir die Zellen in klonalen Populationen zu entwickeln.

Abstract

Ein zentrales Thema in der Entwicklungsbiologie ist die Diversifizierung der Linien und die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Dies erfordert eine gründliche Analyse der Schicksale der einzelnen Zellen unter normalen und experimentellen Bedingungen. Zu diesem Zweck sind die Transfektion Methoden, die einzigen Vorfahren Ziel eine Voraussetzung. Wir beschreiben hier eine technisch einfache Methode zur Transfektion von einzelnen Zellen in Hühner-Gewebe in-ovo, so dass verlässliche Linie Tracing sowie Genmanipulation. Spezielle Gewebe-Domains werden innerhalb der Somiten oder Neuralrohr gezielte und DNA wird direkt in das Epithel des Interesses injiziert, was zu sporadischen Transfektion von Einzelzellen. Mit den Reportern können klonalen Populationen damit für zurückverfolgt werden bis zu drei Tage, und das Verhalten von genetisch manipulierten klonalen Populationen können mit der Kontrollgruppen verglichen werden. Diese Methode nutzt die Zugänglichkeit der Hühnerembryo mit neuen Tools zur genetischen Manipulation. Wir vergleichen und diskutieren ihre Vorteile gegenüber den weit verbreiteten Methode der Elektroporation und mögliche Anwendungen und den Einsatz in weiteren in-vivo-Modelle sind ebenfalls vorgeschlagen. Wir befürworten die Verwendung dieser Methode als eine wichtige Ergänzung und Ergänzung für bestehende Linie Tracing und genetischen Störungen Werkzeuge.

Protocol

1. Vorbereitung der Mikropipetten

Wir ziehen unsere Pipetten auf einem Standard-Narishige pp-83 Pipette Abzieher mit einer Heizstufe von 13,5. Die genaue Einstellung muss kalibriert werden, mit dem Ziel einer Pipettenspitze Durchmesser zwischen 8 und 10 Mikrometern. Wir verwenden Filament-haltigen Borosilikatglas Rohre mit einem Außendurchmesser von 1,0 mm und einem Innendurchmesser von 0,75 bis 0,78 mm. Die Pipetten sind daher in einer Plastikschale mit den Spitzen aus dem Kontakt mit den Rändern der Schale geschützt sind.

2. DNA-Präparation

Das Plasmid von Interesse ist in DH5 E. transfizierten coli unter Verwendung von Standardverfahren. Übernacht-Kulturen aus einzelnen Kolonien werden verwendet, um das Plasmid mit maxi-prep Kits (kommerzielle Kits tun sollten) zu reinigen. Wir verwenden ein Plasmid-Konzentration von 1,0 ug / ul für nicht-klonale Injektionen. Höhere Konzentrationen erhöhen Verstopfen der Pipettenspitzen. Für klonale Anwendungen sind Plasmid-Konzentrationen wesentlich geringer und muss angepasst werden (siehe unten). Für pCAGG-GFP wurde die optimale Konzentration Herstellung klonaler Ergebnisse zu 0,05-0,1 ug / ul werden. Ein bis 2 ul von Plasmid ist in der Regel pro Experiment verwendet, und eine minimale Menge an Fast-grünes Pulver (Einhaltung der Spitze eines trockenen, scharfen Glaspipette) ist das Plasmid aufgenommen, bevor das Experiment beginnt. Das Plasmid wird dann in einer Tischzentrifuge für 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Dieses Verfahren scheint Pipette-Verstopfung Probleme zu reduzieren.

3. Die Injektion von Embryonen

3.1 Herstellung von Embryonen

Wir verwenden Wachtel sowie Hühnereiern für Injektionszwecke. Die Eier bebrütet werden, liegen auf ihrer Längsachse, bis die gewünschte Entwicklungsstadium. Die Eier werden mit 70% Ethanol abgewischt und trocknen gelassen. Das spitze Ende des Eies ist mit chirurgischen Schere (dies ist nur in Hühnereiern notwendig) und 1 mL (in Wachteln) oder 2 mL (Küken) von Eiweiß wird aus dem Ei mit einem 10-ml-Spritze (19G Nadel) gezogen durchbohrt. Die Löcher werden dann mit heißem Paraffin versiegelt.

Vor der eigentlichen Injektion wird ein Fenster an der Oberseite der Eierschale mit chirurgischer Schere geöffnet. Platzieren Klebeband über der Schale und schneiden durch sie kann dazu beitragen, Ablagerungen von der Schale. PBS-Puffer mit Antibiotika wird sofort in das Ei pipettiert. Um den Embryo zugreifen, sind die Dotter-und / oder Fruchtwasser Membranen ausgeschnitten und umgeleitet über 0,14 mm Insektennadeln auf einen Nadelhalter montiert. Ungiftige Farbe (Pelican # 17) befindet sich unterhalb des Blastoderms zu helfen visualisieren den Embryo injiziert, mit einem Feuer-gezogen Kapillare montiert auf einem Aspirator.

3.2 Laden und Montage von Mikropipetten

Der Abzieher Mikropipetten können mit dem Plasmid durch Feuer-gezogen Kapillaren ausreichenden Durchmesser geladen werden, montiert auf einem Aspirator. Eine minimale Menge an Plasmid wird unter Verwendung der Kapillare und geladen in die Pipette aus seiner Öffnung gegenüber der geschärfte Spitze, und nähert sich der Spitze von innen so weit wie möglich. Die Pipette wird somit auf eine manuelle Luftdruck Injektor auf einem Mikromanipulator montiert geladen. Minimal Druck ausgeübt wird, falls notwendig, um damit die Plasmid-Lösung an die Spitze der Pipette zu erreichen.

3,3 Plasmid Injektion

Die Pipette wird in das flüssige Medium des Eies manipuliert wird, während die Anwendung einiger Luftdruck zu verhindern das Verstopfen der Pipettenspitze. Die entsprechenden Gewebe-Domäne ist durchbohrt. Die Druckänderung als die Spitze des Gewebes eintritt, wird oft genug zur Freigabe mit sichtbarem schnell grün Plasmid. Ist dies nicht der Fall ist, mit leichtem Druck mit der Spritze, bevor das Plasmid / schnell grün ausgestoßen werden. Dieser Vorgang kann entlang der Achse des Embryos wiederholt werden, zum Beispiel in benachbarten Somiten oder entlang dem Umfang des Neuralrohrs. Nach Injektionen kann PBS hinzugefügt werden. Das Fenster ist verschlossen mit Klebeband (Parafilm ist nicht speziell für Wachtel wünschenswert Eier-it erhöht Embryo Sterberaten, vermutlich durch die Blockierung Austausch von Sauerstoff durch die Schale). Die behandelten Embryonen werden in einen Inkubator zurückgegeben. Vermeiden Sie Belüftung und Platz kleinen Behälter mit Wasser in den Inkubator, als sie halten Feuchtigkeit und die Erträge zu steigern helfen.

4. Einstellen Injection von Parametern und Erfolgsraten

Asessing und Kalibrierung von verschiedenen Einspritzparameter ist entscheidend für Anwendungen mit dem Ziel an Single-Cell-Analyse. Nicht jeder Injektion Veranstaltung wird die erfolgreiche Kennzeichnung von einer einzigen Zelle führen. Plasmid-Konzentration zu hoch ist, kann auf nicht-klonale Kennzeichnung führen, während sehr niedrige Konzentrationen führen zu hohen Ausfallraten. Die Konzentration der injizierten Plasmid muss für klonale Injektionen optimiert werden. Wir empfehlen Verdünnung des gesamten gereinigte Plasmid-Lager statt Verdünnung einzelnen preps zu einem vorher festgelegten Konzentration. Die letzterekönnten einige Varianz der Erfolgsquoten, wahrscheinlich aufgrund von Variationen in Reinheit und andere Parameter wie der Anteil der supercoiled Plasmid einzuführen.

4,1 Beurteilung Erfolgsraten von Whole Mount Beobachtung

Erste Bilanz der injizierten Embryonen können durch ganz-mount Beobachtung unter einem Fluoreszenz-Fernglas durchgeführt werden. Sechs bis acht Stunden nach der Injektion sind ausreichend, um Erfolgsraten mit einem pCAGG-enhanced GFP-Konstrukt zu beurteilen. Dies ist unter Angabe der Ziel-Site ist oberflächlich genug, um ohne weiteres ersichtlich (z. B. der dorsalen Somiten, dorsalen Neuralrohr, Ektoderm etc, siehe Abbildung 1A-C.). Dieser Schritt ist besonders hilfreich für die Beurteilung Versuchsreihe ausstellenden entweder zu viele markierte Zellen oder alternativ ohne jegliche fluoreszierenden Zellen. Wenn eine weitere Inkubation gewünscht wird, sollten Antibiotika-haltigen PBS-Lösung, um das Ei nach der Anzeige hinzugefügt werden und die Versiegelung sollte ersetzt werden.

4,2 Beurteilung Klonalität von seriellen Schnitt-Analyse

Das beste Mittel für die Beurteilung der Tarife der erfolgreichen Injektionen wird von seriell-Schnitte injizierten Embryonen und mittels Immunhistochemie auf die markierten Zellen zu visualisieren. Unter diesen Bedingungen können Inkubationszeiten so kurz als 4 Stunden nach der Injektion. Die Embryonen werden fixiert und für die Paraffin-Schnitte (oder Kryoschneiden). Glas montiert Abschnitte werden dann de-paraffinized und Immuno-gefärbte für Reporter Visualisierung. Amplification Methoden wie Biotin-Streptavidin wünschenswert sein könnte. Schließlich werden die Schnittserien gescannt, um markierte Zellen in injiziert Segmenten zu erkennen. Wenn beim ersten Versuche mehrere anstelle einzelner Zellen gewonnen werden, muss die Plasmid-Aktie verwässert und der Vorgang wiederholt werden, bis ausreichende Ergebnisse erzielt werden. Zwei bis 10-fache Verdünnungen des Plasmids Stammlösung kann in den Fällen der Erfolgsraten zu hoch notwendig.

Für jedes Plasmid transfiziert werden, sollte eine gründliche Kalibrierung, Klonalität sorgt wiederholt werden.

5. Repräsentative Ergebnisse

Wir tragen typischerweise eine einzelne Injektion von pCAGG-GFP pro Somiten, während Targeting 6-12 Segmente pro Embryo ^{1 2.} Unter dieser Einstellung kann ein klares Signal von Whole Mount Beobachtung 8 Stunden nach der Injektion festgestellt werden, in mindestens einem Segment eines Embryo von zehn. Unter diesen Bedingungen war die Kennzeichnung weiter bestätigt werden klonale (Abb. 1B, C). Bei der Verwendung von hohen DNA-Konzentrationen können die meisten Embryonen weisen mindestens eine erfolgreiche Injektion, was die Möglichkeit, dass mehrere Zellen transfiziert wurden.

Serielle Abschnitt Analyse ergab, dass klonale Transfektionen erreicht wurden, wenn die Erfolgsquote lag bei etwa 10%. Dies bedeutet, dass um Klonalität zu erreichen, die Technik per Definition ist, höchst ineffizient. Auf der anderen Seite, unter diesen Bedingungen wurden mehr als 93% der positiven Kennzeichnung Veranstaltungen gefunden klonale ¹ sein.

Abbildung 1. Geklonte Injektionen von pCAGGS-GFP in neuronale Vorläuferzellen und Skelettsystems. (AC) Querschnitte zeigen Kennzeichnung der dorsalen Neuralrohr (NT) (A), ventrolateralen Bereich der Dermomyotom (DM) (B), oder zentrale DM Blatt (C) , 6 Std. nach Mikroinjektion von pCAGGS-GFP zu einem einzigen Stammvater. (D) Zwei Tage nach der klonalen Transfektion der zentralen DM, Einzel-Vorläuferzellen generiert Derivate in beiden Dermis (D) sowie Muskel (M) (vgl. Rz. ¹ für Einzelheiten).

Discussion

Das oben beschriebene Verfahren ist eine Abwandlung eines zuvor beschriebenen Technik für die Bereitstellung von lipophilen Farbstoffen kleinzelligem Teilmengen oder einzelne Vorläuferzellen ^3. Es hat drei wesentliche Vorteile gegenüber den Standard-Elektroporation Technik. Erstens bietet es ein Mittel zur Kennzeichnung mit Zuversicht diskreten Stellen in Zielgeweben, so dass viel größere räumliche Auflösung als Elektroporation (siehe z. B. Abbildung 1B, C). Zweitens erlaubt es die Kennzeichnung von einzelnen Zellen, so dass ihre Herkunft in-vivo zu verfolgen unter sonst normalen Bedingungen ^{1 2} (Abbildung 1C, D). Drittens bietet Gen miss-Expression auf der Ebene einzelner Zellen ein Werkzeug für die Untersuchung molekularer Mechanismen der Linie Segregation, für die Untersuchung der Rolle von Wachstumsfaktoren oder anderer Gene auf zelluläre Verhalten in einem ansonsten normalen Hintergrund, etc. Deshalb ergänzt diese Methode die breite Anwendung der Elektroporation Technik und weiteren nutzt die Zugänglichkeit der Vogelembryo zu raum-zeitlich geregelt Gewinn und Verlust der Genfunktion in-vivo.

Eine zunehmend relevante Anwendung ist die Analyse von zellulären Verhaltens in der einzelnen Zelle Ebene (Zellwanderung, axonalen Führung, die Zellteilung etc.) anhand einer neuen Live-Imaging-Technologien ^{4 5 6 7.} In einigen dieser experimentellen Settings, kann es wünschenswert sein, um eine schnelle Aktivierung Reporter Arten (wie Venus-GFP) ⁸ zu verwenden, um eine frühere Darstellung der injizierten Zellen zu ermöglichen.

Angesichts der Einfachheit der Methode hier beschrieben, ist es sehr wahrscheinlich, dass es auch auf andere Tiermodelle wie Zebrafisch und Xenopus angewendet werden. Das System ist sehr einfach einzurichten und zu verwenden, und die größte Schwierigkeit generiert ausreichend große Reihe von markierten Embryonen, sowie das Scannen für markierte Nachkommen in Anwendungen, die serielle-Abschnitte. In unseren Händen, ausgestellt injizierten Zellen eine leicht nachweisbare GFP-Signal für bis zu 3 Tage, aber dieses Parameters ist wahrscheinlich auf die Raten der Zellproliferation ab. Mit einem langlebigen Reporter wie Lac-Z, oder Transposon-vermittelten Gentransfer führt zu stabilen Integration ^9, könnte es möglich sein, zu verlängern Verfolgung der Nachkommen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B