Summary
في هذا البروتوكول نظهر التعبير ، solubilization ، وتنقيتها من بروتين الغشاء أعرب recombinantly ، MexB ، ومجمع للذوبان البروتين المنظفات. MexB هو غشاء المقاومة للأدوية المتعددة من نقل البكتيريا الانتهازية الزائفة الزنجارية الممرض.
Abstract
المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) ، وقدرة الخلايا السرطانية أو الممرض أن تكون مقاومة لطائفة واسعة من الأدوية المضادة للسرطان هيكليا ووظيفيا لا علاقة لها أو المضادات الحيوية ، هي مشكلة الخطيرة الراهنة في مجال الصحة العامة. هذه المقاومة لأدوية متعددة يرجع الى حد كبير على الطاقة التي تعتمد على المضخات هروب المخدرات. مضخات طرد الأدوية المضادة للسرطان أو المضادات الحيوية في الوسط الخارجي ، وخفض تركيزها داخل الخلايا دون عتبة السمية. نحن ندرس المقاومة للأدوية المتعددة في الزائفة الزنجارية ، وهو ممرض الانتهازية التي تسبب الالتهابات البكتيرية في المرضى الذين يعانون من أنواع عديدة من الإصابات أو المرض ، على سبيل المثال ، والحروق أو التليف الكيسي ، وكذلك في المناعية للخطر غسيل الكلى والسرطان وزرع الأعضاء والمرضى. وهروب رأس المال في المضخات الرئيسية MDR P. الزنجارية والمجمعات ثلاثية تتكون من بروتون antiporter الداخلية الغشاء المخدرات (التجمع الوطني الديمقراطي) ، وهي قناة الغشاء الخارجي (OMF) ، وبروتين رابط محيط بالجبلة (MFP) 1-8. التجمع الوطني الديمقراطي والبروتينات هي بروتينات عبر الغشاء OMF. البروتينات عبر الغشاء يشكلون أكثر من 30 ٪ من جميع البروتينات ونسبة 65 ٪ من الأهداف المخدرات الحالي. المجالات عبر الغشاء مسعور جعل البروتينات غير قابلة للذوبان في المخزن مائي. قبل أن تتمكن من البروتين النقي عبر الغشاء ، فمن الضروري ايجاد الظروف العازلة التي تحتوي على المنظفات اللطيفة التي تمكن من solubilized البروتين وبروتين معقد المنظفات (PDC) 9-11. في هذا المثال ، نستخدم البروتينات التجمع الوطني الديمقراطي ، وP. نقل عبر الغشاء MexB الزنجارية ، لشرح كيفية التعبير عن المؤتلف شكلا من بروتين عبر الغشاء ، solubilize باستخدام المنظفات ، ومن ثم تنقية البروتين المجمعات المنظفات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة العامة في التعبير ، وتنقية ، وغيرها الكثير من solubilization بروتينات غشاء أعرب recombinantly. ويمكن في وقت لاحق مجمعات البروتين المنظفات تستعمل لوصف أو البيوكيميائية البيوفيزيائية بما في ذلك الأشعة السينية تحديد بنية الكريستال أو دراسات يشابك.
Protocol
1. اليوم 1 :
يتم ترميز MexB من الزائفة الزنجارية بواسطة pFB101. وكان تضخيم الجين MexB من P. الزنجارية الحمض النووي الجيني وإدراجه في NdeI والمواقع تقييد XhoI من ناقلات + pET30b. وبناء على بصمة hexahistidine C - المحطة.
- يتم استخدام البلازميد لتحويل E. القولونية سلالة C43 (DE3) 12 ، ومطلي من transformants أغار على LB يحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
2. اليوم 2 : الثقافات بين عشية وضحاها :
- في المساء ، وتحصين 4 X 3 الثقافات LB مل يحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكاناميسين من المستعمرات transformant الطازجة. بدلا من ذلك ، يمكن تلقيح الثقافات من بيرم المجمدة.
وتزرع هذه الثقافات صغيرة على الأسطوانة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
3. يوم 3 : النمو 6 ليتر الثقافات :
- في الصباح ، واستخدام الثقافات بين عشية وضحاها لتطعيم 150 LB مل يحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكانامايسين. تنمو ثقافة في 37 درجة مئوية على شاكر.
- في فترة ما بعد الظهر ، واستخدام الثقافة صغيرة لتطعيم 6 × 1L 2XYT وسائل الإعلام التي تحتوي على 30 ميكروغرام / مل الكاناميسين في قوارير Fernbach. (استخدم 25 مل لكل ثقافة لتخفيف 1:40). تنمو الثقافات في 37 درجة مئوية حتى التوصل الى OD 600 من 0،4-0،6 ، على بعد حوالى 1.5 ساعة
- عندما تصل كثافة الثقافات السليم ، وحمل بروتين تعبير بإضافة 0.5 مل IPTG 1M. تطرح جميع القوارير مرة أخرى في وشاكر لهم الاستمرار في النمو عند 30 درجة مئوية خلال الليل.
4. اليوم 4 : حصاد الخلايا وتنقية البروتينات :
- إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني ، الدناز ، والليزوزيم إلى حلول العازلة على النحو التالي : إلى 50 مل من العازلة إعادة تعليق الخلية ، إضافة DNaseI 10 ملغ (0.1 ملغ / مل تركيز النهائي) (1) ، أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص ، وقليل من الليزوزيم . إلى 60 مل من إعادة تعليق غشاء العازلة ، إضافة مثبط البروتياز 1 قرص. آخر مل 50 من العازلة إعادة تعليق الغشاء ، إضافة مثبط البروتياز 1 قرص. إبقاء جميع الحلول الثلاثة على الجليد.
- الطرد المركزي الثقافات و 30 دقيقة 5000 دورة في الدقيقة واسعة النطاق في أجهزة الطرد المركزي لحصاد الخلايا.
- Resuspend الخلايا في خلية 100 مل العازلة إعادة تعليق (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، 2 مم MgCl 2 ، 1 أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص ، 0.1 ملغ / مل الدناز الأول ، قليل من الليزوزيم)
- تمرير حل مرتين عن طريق خلية خلية الضغوط الفرنسية على 12000 رطل (762 ضغط جوي). أبقى جمع lysate خلية في زجاجة الباردة على الجليد.
- نقل lysate الخلية لأنابيب أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي SS34 لإزالة الحطام خلية لمدة 30 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة عند 4 في الدوار SS - 34 درجة مئوية.
- إزالة بعناية طاف في أنابيب Ti647.5 نابذة فائقة السرعة. الطرد المركزي و 50 دقيقة في 40000 دورة في الدقيقة في 4C. تجاهل طاف.
- Resuspend وبيليه ، الذي يحتوي على أغشية الخلايا ، وتقريبا. 25 مل من إعادة تعليق غشاء العازلة (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 1 أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص).
- نقل تعليق غشاء لأنبوب الطرد المركزي نظيفة والطرد المركزي في 40000 دورة في الدقيقة في الدوار Ti647.5 لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تجاهل وطاف resuspend وغسلها بيليه في 25 مل الغشاء غشاء العازلة إعادة تعليق (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 1 أكمل مثبط البروتياز EDTA خالية من قرص).
5. TM البروتين Solublization :
- لأغشية معلق (حوالي 25 مل) ، إضافة 6 مل DDM 10 ٪ (نهائي تركيز المنظفات DDM = 2 ٪) روك الخليط في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
- الطرد المركزي الخليط في 40000 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار Ti647.5 لفصل البروتين المنظفات للذوبان المجمعات من البروتينات غير قابلة للذوبان. حفظ طاف ، والذي يحتوي على البروتين المنظفات MexB المجمعات.
6. IMAC :
- مزيج طاف الحصول عليها من زيادة ونقصان سرعة عالية تقارب مع حبات مخلب المعادن العازلة معايرتها في إعادة تعليق. لاحتضان 1hr على الأسطوانة في 4 درجات مئوية.
- صب المزيج في عمود الجسم خطورة تدفق وتدفق من خلال تجاهل.
- غسل العمود مع 20 مل (حجم العمود 10) من الاحتياطي IMAC وتجليد واغسل (50 ملي العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 0.2 ٪ DDM)
- أزل البروتين مع العازلة شطف IMAC (50 ملي NAP ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 250 مم إيميدازول ، 0.2 ٪ DDM).
- أخذ عينات من 15 ميكرولتر من الكسور شطف ، مزيج من كل منها 15 ميكرولتر 2X العازلة SDS عينة لتحليلها من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد. تدور في microcentrifuge 30sec. تحليل العينات على هلام بولي أكريلاميد SDS 10 ٪ لتقدير حجم ونقاء MexB في كل جزء.
- تجمع الكسور التي تحتوي على البروتين المجمعات MexB المنظفات والتركيز المكثف عليها في زيادة ونقصان في 4 درجات مئوية. كن حذرا أن البروتين لا تترسب في هذه الصفحاتفاتر.
7. هلام العمود الترشيح :
- قبل يوازن من 12 Superose HL 30/10 العمود مع 24 مل العازلة تشغيل (50 ملي برنامج العمل الوطني ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، الجلسرين 5 ٪ ، 0.2 ٪ بيتا octylglucoside) ، والانتظار للحصول على خط ثابت.
- شطف تحميل نظام Akta حلقة مع العازلة على التوالي.
- حل تصفية البروتين باستخدام فلتر حقنة قبل تطبيقه على العمود.
- تحميل ما يصل إلى 240 ميكرولتر من محلول البروتين على العمود ، مع تركيز البروتين تصل إلى 5mg / مليلتر.
- تشغيل وحدات التخزين العمود 1.5 (36 مل) من المخزن ، وجمع الكسور 0.25 مل. ينبغي للبروتين المجمعات المنظفات MexB أزل باعتبارها ذروة عند حوالي 10-15 مل من حجم شطف.
- أخذ عينات 5 ميكرولتر من الكسور الذروة. مزيج كل عينة 01:01 العازلة 2X مع عينة SDS. تحليل العينات على هلام بولي أكريلاميد 10 ٪ لتقدير حجم ونقاء MexB في كل جزء
- تجمع الكسور التي تحتوي على MexB النقي.
8. ممثل النتائج :
الشكل 1 يتضمن هلام بولي أكريلاميد مع كسور العمود مجمعة من العمود IMAC وكسور فردية من هلام العمود الترشيح. بعد هلام العمود الترشيح البروتين النقي يظهر من خلال هلام بولي أكريلاميد Coomassie الملون. الرقم 2 ويشمل تتبع من هلام العمود الترشيح تظهر ذروة الرئيسي للمجمع يبلغ حجمه البروتين المنظفات من العمود. متوسط العائد من البروتين MexB حوالي 2 ملغ لكل ليتر من 6 2XYT الثقافة.
الشكل 1. SDS - PAGE هلام تطهير PDCs MexB. حارة 1 ، علامات الوزن الجزيئي. 2 ، مجمع الكسور IMAC. 3-7 الترشيح الكسور جل العمود.
الشكل 2. مثال على نتائج الترشيح للمجمعات جل MexB المنظفات البروتين (PDC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالإضافة إلى أدوية المتعددة المقاومة ، والعديد من الأنشطة الخلوية الحيوية ، بما في ذلك الاتصالات النقل ايون خلية خلية ، والنقل حويصلة ، وصيانة البنية الخلوية ، والتفاعلات المضيف الممرض ، تنطوي على البروتينات التي هي جزء لا يتجزأ في غشاء الخلية. البروتينات عبر الغشاء يشكلون أكثر من 30 ٪ من البروتينات المعروفة والأهداف هي بالنسبة لغالبية الأدوية المستخدمة اليوم. للطي غير لائق أو نشاط البروتينات عبر الغشاء تؤدي إلى أمراض وراثية هامة ، بما في ذلك التليف الكيسي ، ومرض السكري. على الرغم من أهمية كبيرة من البروتينات عبر الغشاء ، هناك أقل بكثير معروف عن هياكلها والآليات الجزيئية من أجل البروتينات قابلة للذوبان. يمكن وجود تسلسل مسعور تجعل من الصعب التعبير عن وعزل كميات كبيرة من هذه البروتينات وتجعلها الحرارية للعديد من الطرق الحيوية والهيكلية.
أثبت هذا البروتوكول solubilization التعبير المنظفات ، وتنقية البروتين من الغشاء المقاوم للأدوية المتعددة ومجمع البروتين المنظفات القابلة للذوبان. ويمكن استخدام هذه الطرق مع بعض التعديل بالنسبة للعديد من البروتينات عبر الغشاء أعرب recombinantly. الناتج المنظفات البروتين النقي مجمعات القابلة للذوبان ، ويمكن استخدامها للمحاكمات لبلورة البلورات بالأشعة السينية لتحديد الهيكل وغيرها من الخصائص الفيزيائية الحيوية أو الكيمياء الحيوية ، بما في ذلك إعادة أو الدراسات في الليبوزومات يشابك.
خلال إجراءات التطهير ، من المهم أن نكون حذرين أن المجمعات المنظفات البروتين لا تترسب أثناء الخطوات تركيز زيادة ونقصان. ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب مختلفة للمساعدة على تركيز PDC قبل أو بعد هلام خطوة الترشيح ، مثل تكرار الخطوة IMAC مع عمود صغير جدا وصغيرة الحجم شطف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع من خلال منح لCJJ من مؤسسة العلوم الوطنية وجمعية العلوم الجزيئية البيولوجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
