Summary
בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים את הביטוי, solubilization, וטיהור של חלבון קרום הביע recombinantly, MexB, כפי מורכב חלבון מסיס חומר ניקוי. MexB היא התנגדות הממברנה multidrug טרנספורטר מן החיידק Pseudomonas aeruginosa אופורטוניסטית הפתוגן.
Abstract
התנגדות Multidrug (MDR), היכולת של תא סרטני או פתוגן להיות עמידים בפני מגוון רחב של תרופות נוגדות סרטן מבנית או תפקודית ואינו קשור אנטיביוטיקה, היא בעיה רצינית הנוכחי בריאות הציבור. זו התנגדות multidrug נובע במידה רבה אנרגיה תלויי משאבות בזרימת סמים. המשאבות לגרש תרופות נוגדות סרטן או אנטיביוטיקה לתוך המדיום חיצוניים, הורדת ריכוז תאיים שלהם מתחת לסף רעילים. אנחנו לומדים התנגדות multidrug ב Pseudomonas aeruginosa, פתוגן חיידקי אופורטוניסטית שגורם לזיהומים בחולים עם סוגים רבים של פציעה או מחלה, למשל, כוויות או סיסטיק פיברוזיס, וגם חיסונית נפגעת דיאליזה סרטן, חולים להשתלה. בזרימת הגדולות MDR משאבות פ aeruginosa הם קומפלקסים משולשת המורכבת antiporter הפנימית הממברנה פרוטונים סמים (RND), ערוץ הממברנה החיצונית (OMF), לבין חלבון מקשר periplasmic (MFP) 1-8. החלבונים RND ו OMF הם חלבונים הטרנסממברני. חלבונים הטרנסממברני לפצות יותר מאשר 30% של כל החלבונים הם 65% מטרות תרופה הנוכחי. תחומים הטרנסממברני הידרופובי לייצר חלבונים מסיסים חיץ מימית. לפני חלבון הטרנסממברני יכול להיות מטוהרים, יש צורך למצוא את התנאים חוצץ המכיל חומר ניקוי עדין המאפשרים את החלבון להיות solubilized כמתחם אבקת חלבון (PDC) 11/09. בדוגמה זו, אנו משתמשים חלבון RND, פ MexB aeruginosa טרנספורטר הטרנסממברני, כדי להדגים איך לבטא צורה רקומביננטי של חלבון הטרנסממברני, solubilize אותו באמצעות דטרגנטים, ולאחר מכן לטהר את אבקת קומפלקסים חלבונים. שיטה זו בכלל ניתן ליישם את הביטוי, טיהור, ו solubilization של חלבונים רבים אחרים קרום הביע recombinantly. ניקוי קומפלקסים חלבונים יכול מאוחר יותר לשמש אפיון ביוכימי או biophysical לרבות קביעת רנטגן קריסטל מבנה או מחקרים crosslinking.
Protocol
1. יום 1:
MexB מ Pseudomonas aeruginosa מקודד על ידי pFB101. הגן MexB הוגדל מ - פ aeruginosa DNA הגנומי ונוסף על NdeI ואתרי XhoI הגבלה של + pET30b וקטור. לבנות מכיל תג בטרמינל C-hexahistidine.
- פלסמיד משמש כדי להפוך את ה coli זן C43 (DE3) 12, ואת transformants הם מצופה על אגר LB המכיל 30 UG / mL kanamycin.
2. יום 2: תרבויות לינה:
- בערב, 4 X 3 LB המכיל 30 מ"ל תרבויות UG / mL kanamycin הם מחוסן מן המושבות transformant טריים. לחלופין, תרבויות יכול להיות מחוסן מפני סלסול קפוא.
תרבויות אלו קטנים הם גדלו על מכבש על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. יום 3: גידול 6 ליטר תרבויות:
- בבוקר, השתמש תרבויות לילה לחסן LB 150 מ"ל המכיל 30 UG / mL kanamycin. לגדול התרבות ב 37 ° C על שייקר.
- בשעות אחר הצהריים, להשתמש תרבות קטן לחסן 6 x 1 ליטר 2XYT מדיה המכילה 30 UG / kanamycin מ"ל צלוחיות Fernbach. (השתמש 25 מ"ל לכל תרבות לדילול 01:40). לגדול התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים OD של 600 0.4-0.6, כ -1.5 שעות
- כאשר התרבויות להגיע צפיפות נכונה, להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת 0.5 מ"ל 1M IPTG. מכניסים את כל צלוחיות בשנות ה שייקר ולהמשיך לגדל אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. יום 4: קצירת התאים וטיהור חלבון:
- הוסף מעכבי פרוטאז, DNAse ו ליזוזים לפתרונות חיץ כדלקמן: עד 50 מ"ל של חיץ resuspension התא, להוסיף 10 מ"ג DNaseI (0.1 מ"ג / מ"ל בריכוז הסופי), 1 מעכב השלם EDTA ללא פרוטאז הלוח, וקורט ליזוזים . עד 60 מ"ל של חיץ resuspension קרום, להוסיף 1 מעכבי פרוטאז הלוח. כדי 50 מ"ל נוסף של המאגר resuspension קרום, להוסיף 1 מעכבי פרוטאז הלוח. שמור את כל שלושה פתרונות על הקרח.
- צנטריפוגה התרבויות 30 דקות 5,000 סל"ד בצנטריפוגה בקנה מידה גדול כדי לקצור את התאים.
- Resuspend התאים חיץ תא resuspension 100 מ"ל (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, 2 מ"מ MgCl 2, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז, 0.1 מ"ג / מ"ל DNAse אני, קמצוץ של ליזוזים)
- לעבור את פתרון התא פעמיים באמצעות תא הלחץ הצרפתי 12,000 psi (762 מד הלחץ). אסוף את lysate תא בקבוק קר כל הזמן על הקרח.
- מעבירים את lysate התא SS34 צינורות צנטריפוגה ו צנטריפוגות כדי להסיר שאריות תאים למשך 30 דקות בסל"ד 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס הרוטור SS-34.
- הסר בזהירות את supernatant לתוך צינורות Ti647.5 ultracentrifuge. צנטריפוגה 50 דקות בסל"ד 40,000 ב 4C. בטל supernatant.
- Resuspend גלולה, אשר מכיל את קרום התא, על כ. 25 מ"ל של חיץ resuspension קרום (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז).
- מעבירים את ההשעיה קרום לצינור צנטריפוגה צנטריפוגה נקי ב 40,000 סל"ד ב הרוטור Ti647.5 עבור 50 דקות ב 4 ° C.
- בטל supernatant ו resuspend הממברנה גלולה לרחוץ 25 חוצץ קרום מ"ל resuspension (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז).
5. TM Solublization חלבון:
- כדי הממברנות resuspended (כ 25 מ"ל), מוסיפים 6 DDM מ"ל 10% (ריכוז חומר הניקוי הסופי = DDM 2%) רוק את התערובת על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- צנטריפוגה את התערובת בסל"ד 40,000 עבור 40 דקות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור Ti647.5 כדי להפריד אבקת חלבון מסיס קומפלקסים של חלבונים מסיסים. שמור את supernatant, המכיל אבקת חלבון מתחמי MexB.
6. IMac:
- מערבבים את supernatant המתקבל ספין במהירות גבוהה עם זיקה חרוזי מתכת טופר equilibrated במאגר resuspension. דגירה של 1 שעות על רולר בבית 4 ° C.
- יוצקים את התערובת לתוך גוף זרימת הכבידה טור וזורקים את הזרימה דרך.
- לשטוף את הטור עם 20 מ"ל (10 כרכים עמודה) של הצפת מחייב לשטוף iMac (50 NAP מ"מ, ה-pH 7, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, DDM 0.2%)
- Elute את החלבון עם חיץ elution iMac (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 250 מ"מ imidazole, DDM 0.2%).
- קח 15 דגימות μL של שברים elution, לערבב עם כל 15 חיץ μL SDS 2X מדגם לניתוח על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. ספין 30sec ב microcentrifuge. ניתוח דגימות על polyacrylamide של 10% SDS ג'ל לאמוד את הסכום ואת טוהר MexB בשבריר אחד.
- בריכת שברים המכיל את אבקת חלבון מתחמי MexB ולרכז אותם concentrator ספין ב 4 ° C. היזהר כי החלבון אינו המשקע החוצה זה sטפ.
7. סינון ג'ל עמודה:
- טרום לאזן 12 Superose HL 30/10 טור עם חיץ 24 מ"ל ריצה (50 NAP מ"מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 0.2% בטא octylglucoside), ולחכות הבסיס שטוח.
- שוטפים את טעינת מערכת אקטע לולאה עם חיץ פועל.
- סנן הפתרון חלבון באמצעות מסנן מזרק לפני החלת אותו הטור.
- טען עד 240 μL של הפתרון חלבון על הטור, עם ריכוז חלבון של עד 5 מג / מ"ל.
- הפעלה 1.5 כרכים עמודה (36 מ"ל) של חיץ, לאסוף את השברים 0.25 מ"ל. אבקת חלבון מתחמי MexB צריך elute כמו לשיא בסביבות 10-15 מ"ל של נפח elution.
- קחו 5 דגימות μL של שברים שיא. מערבבים את כל מדגם 01:01 עם חיץ מדגם SDS 2X. ניתוח דוגמאות על ג'ל polyacrylamide 10% כדי לאמוד את הסכום ואת טוהר MexB בשבריר כל
- בריכת שברים המכיל MexB טהור.
8. נציג תוצאות:
איור 1 כוללת ג'ל polyacrylamide עם שברים טור נקווה מהעמודה iMac ו שברים בודדים מעמודה הסינון ג'ל. אחרי הטור סינון ג'ל חלבון מופיע טהור על ידי ג'ל polyacrylamide Coomassie מוכתם. איור 2 כולל עקבות מהעמודה ג'ל סינון מראה את השיא העיקרי של משחררי אבקת חלבון מורכב מהעמודה. התשואה הממוצעת של חלבון MexB הוא כ 2 מ"ג 6 ליטרים של תרבות 2XYT.
באיור 1. SDS-PAGE ג'ל של טיהור PDCs MexB. Lane 1, משקל סמנים מולקולריים. 2, משולב שברים iMac. 3-7, טור ג'ל סינון שברים.
איור 2. דוגמה סינון תוצאות ג'ל ניקוי MexB קומפלקסים חלבונים (PDC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בנוסף multidrug, התנגדות פעילויות רבות הסלולר חיוניים, כולל תחבורה ותקשורת יון תאים תאים, תחבורה, שלפוחית, תחזוקה של המבנה התאי, והוא מארח הפתוגן אינטראקציות, לערב חלבונים אשר מוטבעות בתוך קרום התא. חלבונים הטרנסממברני לפצות מעל 30% של חלבונים ידועים הם מטרות עבור רוב התרופות בשימוש כיום. קיפול לא נכון או פעילות של חלבונים הטרנסממברני להוביל מחלות גנטיות חשובות, כולל סיסטיק פיברוזיס סוכרת ו. למרות החשיבות העצומה של חלבונים הטרנסממברני, יש הרבה פחות ידוע על המבנים שלהם ואת המנגנונים המולקולריים מאשר חלבונים מסיסים. נוכחות של רצפי הידרופובי יכול להקשות לבטא לבודד כמויות גדולות של חלבונים אלו והופך אותם עקשן שיטות ביוכימיות מבניים רבים.
פרוטוקול זה הוכיח את הבעת פניו חומר ניקוי solubilization וטיהור של חלבון קרום MDR כמו קומפלקס חלבון מסיס חומר ניקוי. שיטות אלה ניתן להשתמש עם כמה שינויים רבים חלבונים הטרנסממברני הביע recombinantly. כתוצאה מכך מטוהרים ניקוי קומפלקסים חלבונים מסיסים הם יכולים לשמש בניסויים התגבשות להגדרה רנטגן מבנה קריסטלוגרפיים ו לאפיון biophysical או ביוכימיים אחרים, כולל הכינון מחדש לתוך ליפוזומים או מחקרים crosslinking.
במהלך הליכי טיהור, חשוב להיות זהירים כי חומר ניקוי קומפלקסים חלבונים לא להאיץ החוצה במהלך השלבים ריכוז ספין. שיטות שונות עשוי לשמש גם כדי לעזור לרכז את PDC לפני או אחרי צעד את הג'ל סינון, כגון חזרה על צעד iMac עם טור קטן מאוד ונפח elution קטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי מענקים CJJ מן הקרן הלאומית למדע והחברה למדעים Biomolecular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
