Summary
В этом протоколе мы демонстрируем выражения, солюбилизации и очистки рекомбинантно выразил мембранный белок, MexB, как растворимый комплекс моющих средств белка. MexB является множественной лекарственной транспортер сопротивление мембраны от оппортунистических бактериальных патогенов синегнойной палочкой.
Abstract
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), способность раковых клеток или возбудителя устойчивы к широкому кругу структурно и функционально не связанных противораковых препаратов или антибиотиков, в настоящее время является серьезной проблемой в области общественного здравоохранения. Это множественная лекарственная устойчивость во многом объясняется энергозависимых насосов наркотиков истечения. Насосы изгнать противораковых препаратов или антибиотиков во внешнюю среду, снижая их внутриклеточной концентрации ниже токсичного порога. Мы изучаем множественной лекарственной устойчивостью в синегнойной палочки, оппортунистических бактериальный возбудитель, который вызывает инфекции у больных со многими типами травмы или болезни, например, ожогов или кистозный фиброз, а также в с ослабленным иммунитетом рака, диализа и трансплантации пациентам. Основные MDR откачивающих в P. палочки являются трехсторонние комплексы состоят из внутренней оболочки протона с наркотиками антипортера (РНД), внешний канал мембраны (OMF), а периплазматического белка компоновщика (МФУ) 1-8. РНД и OMF белки трансмембранных белков. Трансмембранных белков составляют более 30% всех белков и 65% от текущей лекарственных препаратов. Гидрофобных трансмембранных доменов делают белки нерастворимы в водном буфере. Перед трансмембранный белок может быть очищена, необходимо найти буфера условиях, содержащих мягкого моющего средства, которые позволяют белка в раствор, как белковый комплекс моющих средств (PDC) 9-11. В этом примере мы используем RND белка, П. палочки MexB трансмембранного транспортер, чтобы продемонстрировать, как выразить рекомбинантная форма трансмембранного белка, растворить его, используя моющие средства, а затем очистить белковых комплексов моющего средства. Этот общий метод может быть применен к выражению, очистка и солюбилизации многих других рекомбинантно выразил мембранных белков. Белковых комплексов моющего средства в дальнейшем могут быть использованы для биохимических и биофизических характеристик в том числе рентгеноструктурного определения структуры или сшивания исследований.
Protocol
1. День 1:
MexB с синегнойной палочкой кодируется pFB101. Ген MexB усиливался из P. палочки геномной ДНК и вставляют в NdeI и XhoI ограничение сайты pET30b векторных. Построить содержит С-концевой hexahistidine тега.
- Плазмиды используется для преобразования Е. палочки штамма C43 (DE3) 12, и трансформанты высевают на LB агар, содержащий 30 мкг / мл канамицина.
2. День 2: Ночь культуры:
- Вечером, 4 х 3 мл LB культур, содержащих 30 мкг / мл канамицина засевают из свежих колоний трансформантов. Кроме того, культуры могут быть прививки от замороженных химическую завивку.
Эти небольшие культур, выращенных на ролик при 37 ° С в течение ночи.
3. День 3: Рост 6 литров культур:
- По утрам, используйте ночь культур привить 150 мл LB, содержащей 30 мкг / мл канамицина. Рост культуры при 37 ° С на качалке.
- Во второй половине дня, используйте небольшие культуре привить 6 х 1 л 2XYT среде, содержащей 30 мкг / мл канамицина в колбах FERNBACH. (Используйте 25 мл на культуру для разбавления 1:40). Рост культуры при 37 ° С до достижения ими OD 600 из 0.4-0.6, около 1,5 часов
- Когда культур достигают надлежащей плотности, индуцируют экспрессию белка путем добавления 0,5 мл 1М IPTG. Положите все колбы еще в шейкере и продолжают выращивать их при температуре 30 ° С в течение ночи.
4. День 4: Уборочная клетки и очистки белков:
- Добавить ингибиторы протеазы, ДНКазы, и лизоцима в буферных растворов следующим образом: до 50 мл клеточной буфера ресуспендирования, добавляют 10 мг DNaseI (0,1 мг / мл, конечная концентрация), 1 Полное ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка, и щепотка лизоцима . К 60 мл мембраны буфера ресуспендирования, добавить 1 ингибитор протеазы таблетки. Чтобы еще 50 мл мембраны буфера ресуспендирования, добавить 1 ингибитор протеазы таблетки. Держите все три решения на льду.
- Центрифуга культур 30 мин 5000 оборотов в минуту в крупномасштабных центрифуги для сбора клеток.
- Ресуспендируют клеток в 100 мл ячейки ресуспендирования буфера (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2, 1 Полное ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка, 0,1 мг / мл ДНКазы I, щепотка лизоцима)
- Pass клетка решение дважды через французский ячейке давление на 12000 фунтов на квадратный дюйм (762 манометра). Сбор Клеточный лизат в бутылке держать в холоде на льду.
- Передача Клеточный лизат для SS34 центрифужные пробирки и центрифуги для удаления мусора клетка в течение 30 мин при 10 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в СС-34 ротор.
- Осторожно удалите супернатант в Ti647.5 труб ультрацентрифуге. Центрифуга 50 мин при 40 000 оборотов в минуту при 4С. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют шарик, который содержит клеточные мембраны, в ок. 25 мл буфера ресуспендирования мембраны (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерина, 1 полная ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка).
- Передача суспензии мембран в чистую пробирку центрифуги и центрифуге при 40 000 оборотов в минуту в Ti647.5 ротора в течение 50 минут при 4 ° C.
- Удалите супернатант и ресуспендируйте мыть мембраны гранул в 25 мл буфера ресуспендирования мембраны (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерина, 1 полная ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка).
5. ТМ белка Solublization:
- Для ресуспендировали мембран (около 25 мл), добавляют 6 мл 10% DDM (конечная концентрация моющих средств = 2% DDM) Рок смесь при температуре 4 ° С в течение 2 часов.
- Центрифуга смеси при 40 000 оборотов в минуту в течение 40 мин при 4 ° С в Ti647.5 ротором для разделения растворимых комплексов моющего средства белка из нерастворимые белки. Сохранить супернатант, который содержит MexB комплексов моющего средства белка.
6. IMAC:
- Смешайте надосадочной жидкости, полученной от высокой скорости вращения с металлом коготь близость бисером уравновешенную ресуспендирования буфера. Инкубировать 1 час на роликах при 4 ° C.
- Налейте шлама в колонке тела самотеком и отказаться проходить через.
- Промыть колонку с 20 мл (10 томов столбца) IMAC Связывание и промывочного буфера (50 мМ NaP, рН 7, 300 мМ NaCl, 5% глицерин, 0,2% DDM)
- Элюции белка с IMAC буфера элюирования (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерина, 250 мМ имидазола, 0,2% DDM).
- Возьмите 15 мкл образцов элюирования фракций, смешать каждый с 15 мкл образца 2X SDS буфера для анализа электрофореза в полиакриламидном геле. Спиновые 30 сек в микроцентрифужных. Анализ образцов на 10% полиакриламидном геле SDS оценить количество и чистоту MexB в каждой фракции.
- Бассейн Фракции, содержащие белок MexB моющего средства комплексов и концентрируют их в спину концентратор на 4 ° С. Будьте осторожны, чтобы белок не выпадают в это сТЭП.
7. Колонка гель-фильтрации:
- Предварительно равновесие Superose 12 HL 30/10 колонку с 24 мл работает буфера (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерин, 0,2% бета-octylglucoside), и ждать плоской линии.
- Промыть загрузки Akta системы петля с работы буфера.
- Фильтры раствора белка при помощи шприца фильтра перед его применением к колонке.
- Нагрузка до 240 мкл раствора белка на колонке, с концентрацией белка до 5 мг / мл.
- Выполнить 1,5 колонке объемов (36 мл) буфера, собрать 0,25 мл фракции. MexB белковых комплексов моющего средства должны элюировать как пика на уровне около 10 - 15 мл элюирования объема.
- Возьмите 5 мкл образцов пик фракций. Смешайте каждого образца 1:1 с 2Х буфером образец SDS. Анализ образцов на 10% полиакриламидном геле оценить количество и чистоту MexB в каждой фракции
- Бассейн фракций, содержащих чистый MexB.
8. Представитель Результаты:
Рисунок 1 включает в полиакриламидном геле с объединенные колонки фракций из IMAC колонки и отдельных фракций из колонки гель-фильтрации. После колонке гель-фильтрации белков появляется чистая от окрашенных Кумасси полиакриламидном геле. Рисунок 2 включает в себя след из колонки гель-фильтрации, рассказывающие об основных пика белковый комплекс моющих средств элюирования из колонки. Средняя урожайность белка MexB составляет приблизительно 2 мг в 6 литров 2XYT культуры.
Рисунок 1. SDS-PAGE гель очистки РРЦ MexB. Лейн 1, маркеры молекулярного веса. 2, Объединенные IMAC фракций. 3-7, гель фракции фильтрации столбцов.
Рисунок 2. Пример гель-фильтрации Результаты MexB белка моющего средства комплексов (PDC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В дополнение к лекарственной устойчивости, многие жизненно важные клеточной активности, в том числе транспорт ионов, межклеточной коммуникации, транспорт везикул, поддержание клеточной структуры, а хозяин-патоген взаимодействия, связаны с белками, которые встраиваются в клеточные мембраны. Трансмембранных белков составляют более 30% известных белков и являются целью для большинства фармацевтических препаратов, используемых сегодня. Неправильное складывание или активность трансмембранных белков приводят к важным генетических заболеваний, в том числе муковисцидоз и диабета. Несмотря на огромное значение трансмембранных белков, есть гораздо меньше известно об их структурах и молекулярные механизмы, чем для растворимого белка. Наличие гидрофобных последовательностей может сделать это трудно выразить и изолировать большое количество этих белков и делает их огнеупорных многих биохимических и структурных методов.
Этот протокол продемонстрировал выражения, растворение моющего средства и очистку белка мембраны MDR как растворимый комплекс моющих средств белка. Эти методы могут быть использованы с некоторыми изменениями для многих рекомбинантно выразил белками трансмембранного. В результате очищенный белковых комплексов моющего средства растворимы и могут быть использованы для кристаллизации испытаний для рентгеновских определения структуры кристаллографических и других биофизических и биохимических характеристик, в том числе восстановления в липосомы или сшивания исследований.
Во время процедуры очистки, важно быть осторожным, чтобы белковых комплексов моющего средства не выпадают в течение шаги спина концентрации. Различные методы могут также использоваться, чтобы помочь сконцентрироваться PDC до или после шага гель-фильтрации, такие как повторяющиеся IMAC шаг с очень небольшой колонны и небольшой объем элюирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан грантами для CJJ от Национального научного фонда и Общества биомолекулярных наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
