Summary
En este protocolo se demuestra la expresión, solubilización y purificación de una proteína de membrana recombinante expresado, MexB, como un complejo de proteínas solubles en detergente. MexB es un transportador de membrana de resistencia a múltiples fármacos de la bacteria patógena oportunista Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Resistencia a múltiples fármacos (MDR), la capacidad de una célula cancerosa o patógenos resistentes a un amplio rango de vista estructural y funcionalmente relacionadas fármacos contra el cáncer o los antibióticos, es un problema actual grave en la salud pública. Esta resistencia a múltiples fármacos se debe principalmente a la energía que dependen de las bombas de eflujo de drogas. Las bombas de expulsión de fármacos contra el cáncer o los antibióticos en el medio externo, la reducción de su concentración intracelular por debajo de un umbral tóxico. Estamos estudiando la resistencia a múltiples en Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista bacteriana que causa infecciones en pacientes con muchos tipos de lesiones o enfermedad, por ejemplo, quemaduras o la fibrosis quística, y también en personas inmunodeprimidas cáncer, diálisis y trasplante de los pacientes. El principal flujo de salida de las bombas MDR en P. aeruginosa son complejos tripartito formado por una membrana interna de protones antiporter drogas (RND), un canal de membrana externa (OMF), y una proteína de enlazador periplasmic (MFP) 1-8. Las proteínas RND y OMF son proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana representan más del 30% de todas las proteínas y son un 65% de los objetivos actuales de drogas. Los dominios transmembrana hidrofóbica que las proteínas insolubles en tampón acuoso. Antes de que una proteína transmembrana puede ser purificado, es necesario encontrar las condiciones de tampón que contiene un detergente suave que permite que la proteína se solubiliza como un complejo de proteínas de detergente (PDC) 11.09. En este ejemplo, se utiliza una proteína RND, el P. MexB aeruginosa transportador transmembrana, para demostrar la manera de expresar una forma recombinante de una proteína transmembrana, que solubilizan el uso de detergentes, y luego purificar los complejos de proteínas de detergente. Este método general se puede aplicar a la expresión, purificación, y la disolución de muchas otras proteínas de membrana recombinantes expresadas. Los complejos de detergente proteína pueda ser utilizado posteriormente para la caracterización bioquímica y biofísica incluyendo rayos X de la determinación de la estructura cristalina o estudios de entrecruzamiento.
Protocol
1. Día 1:
MexB de Pseudomonas aeruginosa es codificada por pFB101. El gen se amplificó a partir MexB P. aeruginosa ADN genómico y se inserta en el NdeI y XhoI sitios de restricción del vector pET30b +. La construcción contiene una etiqueta hexahistidina C-terminal.
- El plásmido se utilizó para transformar E. coli cepa C43 (DE3) 12, y los transformantes se sembraron en agar LB que contenían 30 ug / ml de kanamicina.
2. Día 2: cultivos de una noche:
- Por la noche, 4 x 3 culturas LB ml que contienen 30 ug / ml kanamicina se inoculan de las colonias transformantes fresco. Por otra parte, los cultivos pueden ser inoculados a partir de una permanente congelado.
Estas pequeñas culturas se cultivan en una montaña a 37 ° C durante la noche.
3. Día 3: Crecimiento 6 litros culturas:
- Por la mañana, el uso de las culturas durante la noche para inocular 150 ml de LB conteniendo 30 ug / ml de kanamicina. Mantener el cultivo a 37 ° C en un agitador.
- Por la tarde, el uso de la cultura pequeños para inocular 6 x 1L 2XYT los medios de comunicación que contiene 30 ug / ml de kanamicina en frascos Fernbach. (Use 25 ml por la cultura de una dilución 1:40). Crecen los cultivos a 37 ° C hasta alcanzar una OD 600 de 0.4-0.6, alrededor de 1,5 horas
- Cuando las culturas alcanzar la densidad adecuada, induce la expresión de proteínas mediante la adición de 0,5 ml de IPTG 1M. Poner todos los frascos de vuelta en la coctelera y continuar a crecer a 30 ° C durante la noche.
4. Día 4: Recolección de Células y purificar la proteína:
- Añadir inhibidores de la proteasa, ADNasa y lisozima a las soluciones tampón de la siguiente manera: A 50 ml de tampón de resuspensión de células, agregar 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml concentración final), una completa EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa, y una pizca de lisozima . A 60 ml de solución tampón de resuspensión de membrana, añadir 1 tableta de inhibidor de la proteasa. A otro de 50 ml de solución tampón de resuspensión de membrana, añadir 1 tableta de inhibidor de la proteasa. Mantener las tres soluciones en el hielo.
- Centrifugar los cultivos de 30 minutos 5.000 rpm en gran escala centrífuga para cosechar las células.
- Resuspender las células en 100 ml de tampón de resuspensión de células (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa, 0,1 mg / ml de DNAsa I, una pizca de lisozima)
- Pase la solución de células dos veces a través de una célula de presión francesa a 12.000 psi (762 presión manométrica). Recoger el lisado celular en una botella de mantenerse en frío sobre el hielo.
- Transferir el lisado celular a SS34 tubos de centrífuga y centrifugar para eliminar los desechos celulares durante 30 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C en un rotor SS-34.
- Retire con cuidado el sobrenadante en tubos Ti647.5 ultracentrífuga. Centrifugar 50 min a 40.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado, que contiene las membranas celulares, en aprox. 25 ml de buffer de resuspensión de membrana (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, un completo EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa).
- La transferencia de la suspensión de membrana a un tubo de centrífuga limpio y centrifugar a 40.000 rpm en un rotor Ti647.5 durante 50 min a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet se lavó la membrana en 25 ml de tampón de resuspensión de membrana (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, un completo EDTA libre de tabletas inhibidor de la proteasa).
5. TM Solublization Proteínas:
- A las membranas se resuspendieron (unos 25 ml), añadir 6 mL DDM 10% (concentración de detergente final DDM = 2%) Rock de la mezcla a 4 ° C durante 2 horas.
- Centrifugar la mezcla a 40.000 rpm durante 40 min a 4 ° C en el rotor Ti647.5 para separar los complejos de proteínas solubles en detergente de las proteínas insolubles. Guardar el sobrenadante, que contiene los complejos de proteínas MexB detergente.
6. IMAC:
- Se mezcla el sobrenadante obtenido de la velocidad de centrifugado de alta afinidad con las cuentas garra de metal equilibrada en buffer de resuspensión. Incubar durante 1 hora en un rodillo a 4 ° C.
- Vierta la mezcla en un cuerpo de gravedad columna de flujo y descartar el flujo a través.
- Lavar la columna con 20 ml (10 volúmenes de columna) de tampón IMAC encuadernación y lavado (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 0,2% DDM)
- Eluir la proteína con tampón de elución IMAC (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 250 mM de imidazol, 0,2% DDM).
- Tomar 15 muestras l de las fracciones de elución, mezclar cada uno con 15 ul buffer 2X SDS muestra para el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida. Girar 30 segundos en una microcentrífuga. Analizar las muestras en un 10% de poliacrilamida SDS gel para estimar la cantidad y la pureza de MexB en cada fracción.
- Piscina de las fracciones que contienen los complejos de proteínas MexB detergente y concentrarlos en un concentrador de giro a 4 ° C. Tenga cuidado de que la proteína no se precipitan en este step.
7. Gel columna de filtración:
- Pre-equilibrar una Superose 12 HL 30/10 columna con tampón 24 mL correr (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 0,2% de beta-octilglucósido), y esperar a que una línea de base plana.
- Enjuague el sistema Akta bucle de carga con tampón en funcionamiento.
- Filtrar la solución de proteína usando un filtro de jeringa antes de aplicar a la columna.
- De carga de hasta 240 l de la solución de proteína en la columna, con una concentración de proteína de hasta 5 mg / ml.
- Ejecutar 1,5 volúmenes de columna (36 mL) de tampón, recoger las fracciones 0,25 ml. Los complejos de proteínas MexB detergente debe eluir como un pico de alrededor de 10 a 15 ml de volumen de elución.
- Tomar muestras de 5 l de las fracciones del pico. Mezcle cada muestra 1:1 con tampón de muestra 2X SDS. Analizar las muestras en un gel de poliacrilamida al 10% para estimar la cantidad y la pureza de MexB en cada fracción
- Piscina de las fracciones que contienen MexB puro.
8. Los resultados representativos:
La figura 1 incluye un gel de poliacrilamida con fracciones de columna combinada de la columna IMAC y distintas fracciones de la columna de filtración en gel. Después de la columna de filtración en gel de la proteína aparece puro gel de poliacrilamida teñidos con Coomassie. Figura 2 se incluye una traza a partir de la columna de filtración en gel que muestra el pico principal de la elución de proteínas complejas detergente de la columna. El rendimiento promedio de proteína MexB es de aproximadamente 2 mg por cada 6 litros de cultivo 2XYT.
Figura 1. SDS-PAGE gel de purificación del PDC MexB. Carril 1, marcadores de peso molecular. 2, agrupados fracciones IMAC. 3-7, Gel fracciones columna de filtración.
Figura 2. Ejemplo de los resultados de filtración en gel para los complejos de proteínas MexB detergente (PDC).
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Discussion
Además de la resistencia a múltiples fármacos, muchas de las actividades celulares vitales, incluyendo el transporte de iones, la comunicación celular, el transporte de vesículas, el mantenimiento de la estructura celular, y las interacciones huésped-patógeno, involucrar a las proteínas que se incrustan en la membrana celular. Proteínas transmembrana representan más del 30% de proteínas conocidas y son el objetivo de la mayoría de los fármacos actualmente en uso. El plegado inapropiada y la actividad de las proteínas transmembrana dar lugar a importantes enfermedades genéticas, como la fibrosis quística y diabetes. A pesar de la enorme importancia de las proteínas transmembrana, que es mucho menos conocido por sus estructuras y mecanismos moleculares de las proteínas solubles. La presencia de secuencias hidrofóbicas pueden hacer difícil de expresar y aislar grandes cantidades de estas proteínas y los hace resistente a muchos de los métodos bioquímicos y estructurales.
Este protocolo ha demostrado la expresión, la solubilización de detergente y la purificación de una proteína de membrana MDR como un complejo de proteínas solubles en detergente. Estos métodos se pueden utilizar con algunas modificaciones para muchas proteínas transmembrana recombinante expresado. El resultante se purificó complejos detergente proteínas son solubles y se pueden utilizar para los ensayos de cristalización de rayos X de determinación de la estructura cristalográfica y para la caracterización de otros biofísicos o bioquímicos, incluida la reconstitución en liposomas o estudios de entrecruzamiento.
Durante los procesos de purificación, es importante tener cuidado de que los complejos de proteínas detergente no precipitarse en los pasos de giro de concentración. Diferentes métodos también puede ser utilizado para ayudar a concentrar el PDC antes o después de la etapa de filtración en gel, como repitiendo el paso IMAC con una columna muy pequeño y el volumen de elución pequeños.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado por becas de CJJ de la Fundación Nacional de Ciencias y la Sociedad de Ciencias Biomolecular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
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