Summary
Dans ce protocole, nous démontrons l'expression, la solubilisation et la purification d'une protéine membranaire exprimée par recombinaison, MexB, comme un complexe de protéines solubles de détergent. MexB est un transporteur de multirésistance membrane du opportunistes Pseudomonas aeruginosa bactérie pathogène.
Abstract
La multirésistance (MDR), la capacité d'une cellule cancéreuse ou pathogène pour être résistant à un large éventail de structurellement et fonctionnellement indépendantes des médicaments anticancéreux ou des antibiotiques, est un problème actuel graves en santé publique. Cette multirésistance est largement due à l'énergie dépendant de pompes à efflux de médicaments. Les pompes à expulser les médicaments anti-cancer ou des antibiotiques dans le milieu extérieur, abaissant leur concentration intracellulaire en dessous d'un seuil toxique. Nous étudions la multirésistance chez Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste bactérienne qui provoque des infections chez les patients atteints de nombreux types de blessures ou de maladie, par exemple, de brûlures ou de fibrose kystique, et aussi dans l'immuno-compromis du cancer, de dialyse, transplantation et les patients. Les pompes à efflux MDR majeurs dans P. aeruginosa sont des complexes tripartite composé d'une membrane protonique-drogue antiporteur intérieure (RND), un canal de la membrane externe (OMF), et une protéine de liaison périplasmique (PMF) 1-8. Les protéines RND et OMF sont des protéines transmembranaires. Protéines transmembranaires forment plus de 30% de toutes les protéines et 65% sont des cibles pour les médicaments actuels. Les domaines transmembranaires hydrophobes fabriquer les protéines insolubles dans un tampon aqueux. Avant une protéine transmembranaire peut être purifié, il est nécessaire de trouver des conditions de tampon contenant un détergent doux qui permettent à la protéine d'être solubilisé comme un complexe protéique de détergent (PDC) 9-11. Dans cet exemple, nous utilisons une protéine RND, le P. transporteur transmembranaire aeruginosa MexB, pour démontrer comment exprimer une forme recombinante d'une protéine transmembranaire, solubiliser l'utiliser de détergents, et ensuite de purifier les complexes protéiques de détergent. Cette méthode générale peut être appliquée à l'expression, la purification et la solubilisation de nombreuses autres protéines membranaires par recombinaison exprimée. Les complexes protéiques de détergent peuvent ensuite être utilisés pour la caractérisation biochimique ou biophysique, y compris aux rayons X la structure cristalline de détermination ou d'études de réticulation.
Protocol
1. Jour 1:
MexB de Pseudomonas aeruginosa est codée par pFB101. Le gène a été amplifié à partir MexB P. ADN génomique aeruginosa et inséré dans le Ndel et des sites de restriction Xhol du vecteur pET30b +. La construction comporte une étiquette hexahistidine C-terminale.
- Le plasmide est utilisé pour transformer E. coli souche C43 (DE3) 12, et les transformants sont étalés sur gélose LB contenant 30 ug / ml de kanamycine.
2. Jour 2: cultures de la nuit:
- Dans la soirée, 4 X 3 cultures LB ml contenant 30 ug / ml de kanamycine sont inoculés à partir des colonies transformantes frais. Alternativement, les cultures peuvent être inoculés à partir d'un perm congelés.
Ces petites cultures sont cultivées sur un rouleau à 37 ° C pendant la nuit.
3. Jour 3: Grandir 6 litres cultures:
- Dans la matinée, l'utilisation des cultures durant la nuit pour inoculer 150 ml LB contenant 30 ug / ml de kanamycine. Cultiver la culture à 37 ° C sur un agitateur.
- Dans l'après-midi, utilisez la petite culture pour inoculer 6 x 1L 2xYT supports contenant 30 ug / ml de kanamycine dans des flacons Fernbach. (Utilisez 25 ml par la culture pour une dilution 1:40). Cultivez les cultures à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent une DO 600 de 0,4-0,6, à environ 1,5 heures
- Lorsque les cultures atteignent la bonne densité, induisent l'expression des protéines en ajoutant 0,5 ml d'IPTG 1M. Mettre tous les flacons de retour dans le shaker et continuer à les pousser à 30 ° C pendant la nuit.
4. Jour 4: prélèvement de cellules et de purification des protéines:
- Ajouter les inhibiteurs de protéase, DNAse, et le lysozyme aux solutions tampons comme suit: Pour 50 mL de tampon de resuspension cellulaire, ajoutez 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml en concentration finale), 1 EDTA complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase, et une pincée de lysozyme . À 60 ml de tampon de resuspension membrane, ajouter 1 comprimé d'inhibiteur de protéase. Pour une autre 50 ml de tampon de resuspension membrane, ajouter 1 comprimé d'inhibiteur de protéase. Conservez tous les trois solutions sur la glace.
- Centrifuger les cultures 30 min 5000 rpm à grande échelle centrifugeuse pour récolter les cellules.
- Resuspendre les cellules dans 100 ml tampon de resuspension cellulaire (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, MgCl2 2 mM, EDTA 1 complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase, 0,1 mg / mL DNAse I, une pincée de lysozyme)
- Faire passer la solution de cellules à deux reprises grâce à une cellule de pression française à 12.000 psi (762 pression manométrique). Recueillir le lysat cellulaire dans une bouteille conservés au froid sur la glace.
- Transférer le lysat cellulaire à la SS34 tubes à centrifuger et centrifuger pour enlever les débris cellulaires pendant 30 min à 10000 rpm à 4 ° C dans un rotor SS-34.
- Retirer délicatement le surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation Ti647.5. Centrifuger 50 min à 40000 rpm à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Reprendre le culot, qui contient les membranes cellulaires, à env. 25 ml de tampon de resuspension de membrane (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 1 EDTA complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase).
- Transférer la suspension de membrane d'un tube à centrifuger et centrifuger à nettoyer 40 000 rpm dans un rotor Ti647.5 pendant 50 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et remettre la membrane culot lavé dans 25 ml tampon de resuspension de membrane (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 1 EDTA complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase).
5. Solublization protéine TM:
- Pour les membranes en suspension (environ 25 ml), ajouter 6 mL DDM 10% (concentration finale de détergent DDM = 2%) Rock le mélange à 4 ° C pendant 2 heures.
- Centrifuger le mélange à 40000 rpm pendant 40 min à 4 ° C dans le rotor Ti647.5 pour séparer les protéines des complexes solubles de détergent à partir des protéines insolubles. Enregistrer le surnageant, qui contient les complexes protéiques MexB détergent.
6. IMAC:
- Mélanger le surnageant obtenu à partir de la rotation à haute vitesse avec des perles en métal Talon l'affinité équilibrée dans le tampon de resuspension. Incuber pendant 1 heure sur un rouleau à 4 ° C.
- Verser la pâte dans un corps de colonne à écoulement par gravité et jetez le débit à travers.
- Laver la colonne avec 20 ml (10 volumes de colonne) de tampon de liaison et de laver IMAC (50 NaP mM, pH 7, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 0,2% DDM)
- Eluer la protéine avec le tampon d'élution IMAC (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 250 mM imidazole, 0,2% DDM).
- Prenez 15 uL échantillons des fractions d'élution, mélanger chacune avec 15 pi de tampon d'échantillon 2X SDS pour l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Spin de 30 secondes dans une microcentrifugeuse. Analyser les échantillons sur un 10% gel SDS de polyacrylamide d'estimer la quantité et la pureté de MexB dans chaque fraction.
- Piscine des fractions contenant les complexes de protéines et de détergent MexB les concentrer dans un concentrateur tournent à 4 ° C. Veillez à ce que la protéine n'a pas précipiter à ce step.
7. Colonne de filtration sur gel:
- Pré-équilibrer une Superose 12 HL 30/10 colonne avec 24 ml de tampon de fonctionnement (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 0,2% de bêta-octylglucoside), et d'attendre une base plate.
- Rincer la boucle Akta système de chargement avec un tampon de course.
- Filtrer la solution de protéines en utilisant un filtre à seringue avant de l'appliquer à la colonne.
- Chargez jusqu'à 240 ul de la solution de protéines sur la colonne, avec une concentration en protéines d'un maximum de 5 mg / ml.
- Exécuter 1,5 volumes de colonne (36 ml) de tampon, de collecter 0,25 ml fractions. Les complexes protéiques MexB détergent doit éluer comme un pic autour de 10 - 15 ml de volume d'élution.
- Prenez 5 échantillons uL des fractions de pointe. Mélanger chaque échantillon avec le tampon de 01h01 2X échantillon de SDS. Analyser les échantillons sur un gel de polyacrylamide 10% à estimer la quantité et la pureté de MexB dans chaque fraction
- Piscine des fractions contenant MexB pur.
8. Les résultats représentatifs:
Figure 1 comprend un gel de polyacrylamide avec des fractions de colonne en commun de la colonne IMAC et fractions individuelles de la colonne de filtration sur gel. Après la colonne de filtration sur gel de la protéine semble pure par gel de polyacrylamide Coomassie tachés. La figure 2 comprend une trace de la colonne de filtration sur gel montrant le pic principal de l'élution complexe protéique de détergent de la colonne. Le rendement moyen de protéines MexB est d'environ 2 mg par 6 litres de culture 2xYT.
Figure 1. Gel SDS-PAGE de la purification du PDC MexB. Lane 1, les marqueurs de poids moléculaire. 2, Pooled fractions IMAC. 3-7, les fractions sur colonne de gel filtration.
Figure 2. Exemple de résultats filtration sur gel pour les complexes protéiques MexB détergents (PDC).
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Discussion
En plus de la multirésistance, de nombreuses activités vitales cellulaires, y compris le transport des ions, la communication cellulaire, le transport des vésicules, le maintien de la structure cellulaire et interactions hôtes-pathogènes, impliquent des protéines qui sont incorporés dans la membrane cellulaire. Protéines transmembranaires forment plus de 30% de protéines connues et sont la cible de la majorité des produits pharmaceutiques en usage aujourd'hui. Le pliage incorrect ou l'activité de protéines transmembranaires conduire à d'importantes maladies génétiques, y compris la fibrose kystique et le diabète. En dépit de la grande importance des protéines transmembranaires, il est beaucoup moins connu au sujet de leurs structures et les mécanismes moléculaires que pour les protéines solubles. La présence de séquences hydrophobes peuvent rendre difficile d'exprimer et d'isoler de grandes quantités de ces protéines et les rend réfractaires à de nombreuses méthodes biochimiques et structurelles.
Ce protocole a démontré la solubilisation du détergent expression et la purification d'une protéine membranaire MDR comme un complexe de protéines solubles de détergent. Ces méthodes peuvent être utilisées avec certaines modifications pour de nombreuses protéines transmembranaires exprimés par recombinaison. La purifié résultant des complexes protéiques de détergent sont solubles et peuvent être utilisés pour des essais de cristallisation pour les rayons X détermination de la structure cristallographique et de la caractérisation biophysique et biochimique d'autres, y compris la reconstitution dans des liposomes ou des études de réticulation.
Pendant les procédures de purification, il est important de veiller à ce que les complexes protéiques de détergent ne se précipitent pas au cours des étapes de concentration spin. Différentes méthodes peuvent également être utilisés pour aider à concentrer la PDC avant ou après l'étape de filtration sur gel, comme répéter l'étape iMac avec une colonne très petits et petits volume d'élution.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par des subventions aux CJJ de la National Science Foundation et la Société des sciences biomoléculaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
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