Summary
Bu protokolde, çözünebilir bir protein deterjan kompleksi olarak, ifade, çözünmüş ve recombinantly ifade membran proteini, MexB arıtma göstermektedir. MexB fırsatçı bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa bir çok ilaca direnç membran taşıyıcı.
Abstract
Çok ilaca direnç (MDR), bir kanser hücresi ya da patojen yeteneği, geniş bir yelpazede yapısal ve işlevsel olarak ilgisi olmayan bir anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik dirençli olduğu, halk sağlığı alanında geçerli bir ciddi bir sorundur. Bu ilaca direnci büyük ölçüde bağımlı enerji ilaç dışarı atım pompaları nedeniyle. Pompaları, dış ortama toksik bir eşiğin altında kendi hücre içi konsantrasyonu düşürücü anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik sınırdışı. Biz örneğin, yanıklara veya kistik fibrozis, ve aynı zamanda immün sistemi zayıf olan kanser, diyaliz, ve transplantasyon hastaları, çok ilaca direnç Pseudomonas aeruginosa, birçok yaralanma veya hastalık türleri olan hastalarda enfeksiyonlarına neden olan fırsatçı bir bakteriyel patojen eğitim görmektedir. P. büyük MDR efflux pompaları aeruginosa bir iç membran proton-ilaç antiporter (RND), bir dış membran kanal (OMF) ve bir periplazmik bağlayıcının protein (MFP) 1-8 oluşan üçlü kompleksler. RND ve OMF proteinler transmembran proteinlerdir. Transmembran proteinler tüm proteinlerin% 30'dan fazla makyaj ve% 65 ilaç hedefleri vardır. Hidrofobik transmembran alanları, sulu tampon proteinler çözünmez yapın. Transmembran protein saflaştırılmış önce, hafif bir deterjan içeren bir protein deterjan kompleksi (PDC) 9-11 olarak çözünür protein sağlayacak bir tampon koşulları bulmak için gerekli. Bu örnekte, bir RND protein, P. aeruginosa MexB transmembran taşıyıcı bir transmembran protein rekombinant formu, ifade, bu deterjan kullanarak çözünür ve ardından, protein deterjan kompleksleri arındırmak için nasıl göstermek için. Bu ifade, arıtma, ve diğer birçok recombinantly ifade zarı proteinleri çözünürleştirme genel yöntemi uygulanabilir. Protein deterjan kompleksleri, daha sonra X-ray kristal yapı tayini veya çapraz bağlanma çalışmaları da dahil olmak üzere biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kullanılabilir.
Protocol
1. 1. Gün:
Pseudomonas aeruginosa MexB pFB101 kodlanır. P. MexB geni amplifiye edildi aeruginosa genomik DNA ve NdeI ve XhoI kısıtlama siteleri pET30b + vektör eklenir. Bir yapı, bir C-terminal hexahistidine etiketi içerir.
- Plazmid E. dönüştürmek için kullanılır. coli C43 (de3) 12 suşu ve 30 ug / ml kanamisin içeren LB agar transformants kaplanmıştır.
2. 2. Gün: Gecelik Kültürler:
- Akşam, 30 ug / ml kanamisin içeren 4 x 3 ml LB kültürleri taze transformant koloniler inoküle. Alternatif olarak, donmuş bir perma kültürleri inoküle olabilir.
Bu küçük kültürleri ° C gecede 37 rulo yetiştirilmektedir.
3. 3. Gün: 6 Litre Kültürler Büyüyen:
- Sabah, 30 ug / ml kanamisin içeren 150 ml LB aşılamak için gecelik kültürler kullanın. 37 ° C üzerinde bir çalkalayıcı kültür büyütün.
- Öğleden sonra, 6 x 30 ug / ml kanamisin FERNBACH şişeler içeren 1L 2XYT medya aşılamak için küçük bir kültür kullanın. (01:40 seyreltme başına 25 ml kültür kullanın). 37 ° kültürler büyütün ° C, 1,5 saat, 0.4-0.6 bir OD 600 ulaşana kadar
- Kültürler uygun yoğunluğa ulaştığında, 0.5 ml 1M IPTG ekleyerek protein ekspresyonu neden olur. Çalkalayıcı tüm şişeler geri koyun ve 30 ° C gece büyümeye devam ediyor.
4. 4. Gün: Hücreler Hasat ve Protein Arındırıcı:
- Tampon çözeltiler aşağıdaki gibi proteaz inhibitörleri, DNAz ve lizozim: 50 ml hücre tabanda tampon, 10 mg DNaseI (0.1 mg / ml son konsantrasyon), lizozim, EDTA-1 Komple proteaz inhibitörü tablet ve bir tutam ekleyin . Membran tabanda tampon 60 ml, 1 proteaz inhibitörü tablet ekleyin. Membran tabanda tampon başka bir 50 ml, 1 proteaz inhibitörü tablet ekleyin. Buz üzerinde her üç çözüm tutun.
- Kültürler hücrelerin hasat büyük ölçekli santrifüj 30 dakika 5.000 rpm santrifüjleyin.
- 100 ml hücre tabanda tamponu (50 mM lizozim NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Komple EDTA-proteaz inhibitörü tablet, 0.1 mg / ml DNAz I, çimdik) hücrelerin yeniden süspanse
- 12.000 psi (762 gösterge basıncı) bir Fransız basınç hücresi ile iki kez hücre çözümü iletin. Bir şişe içinde hücre lizat toplayın buz soğuk tuttu.
- SS34 santrifüj tüplerine hücre lizat transferi ve 10.000 rpm'de 30 dakika süreyle, 4 hücre enkaz kaldırmak için santrifüj ° C SS-34 rotor.
- Süpernatantı Ti647.5 ultrasantrifüjdeki tüpler içine dikkatlice çıkarın. 4C az 40.000 rpm de 50 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
- Yaklaşık, hücre zarları içeren pelet, tekrar Membran tabanda tampon 25 ml (50 NaP mM, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol, 1 Komple EDTA-proteaz inhibitörü tablet).
- 4 50 dakika için bir Ti647.5 rotor 40.000 rpm temiz bir santrifüj tüpüne ve santrifüj membran süspansiyon transfer ° C
- Süpernatantı atın ve 25 ml membran tabanda tampon yıkanmış membran pelet (50 NaP mM, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol, 1 Komple EDTA-proteaz inhibitörü tablet) tekrar süspansiyon haline getirin.
5. TM Protein Solublization:
- Yeniden süspanse membranlar (yaklaşık 25 ml), 6 mL% 10 DDM (son deterjan konsantrasyonu = 2% DDM) Rock karışımı 4 ° C'de 2 saat.
- 4 en az 40 dakika 40.000 rpm'de karışımı Santrifüj ° C çözünmez proteinler çözünür protein deterjan kompleksleri ayrı Ti647.5 rotor. MexB protein deterjan kompleksleri içeren süpernatant kaydedin.
6. IMAC:
- Tabanda tampon dengelenmiş masadan metal afinite boncuklar ile yüksek hızda spin elde edilen süpernatant karıştırın. 4 rulo 1hr inkübe ° C.
- Gravite akışı sütun vücuda şerbeti dökün ve akış atmak.
- IMAC Cilt ve Yıkama Tamponu 20 ml (10 sütun cilt) (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl,% 5 gliserol,% 0.2 DDM) ile sütun yıkayın
- IMAC elüsyon tamponu (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol, 250 mM imidazol,% 0.2 DDM) ile protein Zehir.
- Elüsyon kesirler 15 mcL numune alınması, poliakrilamid jel elektroforez ile analizi için 15 mcL 2X SDS numune tamponu ile her karıştırın. Bir mikrosantrifüj 30sn Spin. Her bir fraksiyon MexB ve saflık miktarını tahmin etmek için% 10 poliakrilamid SDS jel örnekleri analiz edin.
- MexB protein deterjanı kompleksleri ve 4 bir spin konsantratör onları konsantre içeren kesirler Havuzu ° C, protein, bu s çökelerek olmadığını dikkatli olunTep.
7. Jel Filtrasyon Sütun:
- 24 ml çalıştıran tamponu (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl,% 5 gliserol,% 0.2 beta-octylglucoside) ile Superose 12 HL 30/10 sütun Öncesi dengelenmesi ve düz bir taban için bekleyin.
- Akta sistemi yükleme döngüsü çalışan tamponu ile durulayın.
- Filtre sütun uygulamadan önce bir şırınga filtresi kullanarak protein solüsyonu.
- 5 mg / ml 'ye kadar bir protein konsantrasyonu, protein çözüm sütun üzerine 240 mcL yükleyin.
- Run 1.5 tampon sütun hacimleri (36 ml), 0.25 ml kesirler toplamak. Elüsyon hacmi 15 mL - MexB protein deterjan kompleksleri yaklaşık 10 pik olarak Zehir gerekir.
- Pik kesirler 5 mcL örnekleri alın. Her örnek 01:01 2X SDS numune tamponu ile karıştırın. Her fraksiyonu MexB miktarı ve saflık tahmin etmek için% 10 poliakrilamid jel üzerinde numunelerin analiz
- Saf MexB içeren kesirler Havuzu.
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1 jel filtrasyon sütundan IMAC sütun ve bireysel kesirler birleştirilmiş sütun fraksiyonları ile poliakrilamid jel içerir. Jel filtrasyon sütun sonra protein Coomassie lekeli poliakrilamid jel saf görünür. Şekil 2 jel filtrasyon sütun sütun protein deterjan kompleksi salınımlı ana zirve gösteren bir iz içerir. MexB protein ortalama verim, 2XYT kültür 6 litre başına yaklaşık olarak 2 mg.
Şekil 1. SDS-PAGE jel MexB PDC saflaştırılması. Lane 1, Molekül ağırlığı işaretleri. 2, IMAC kesirler Pooled. 3-7, Jel filtrasyon sütun kesirler.
Şekil 2. MexB protein deterjan kompleksleri (PDC) Jel Filtrasyon Sonuçlar örneği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direnci, iyon transportu, hücre-hücre iletişimi, vezikül taşıma, hücresel yapı bakım ve konak-patojen etkileşimi de dahil olmak üzere pek çok yaşamsal hücresel faaliyetler, ilaca ek olarak, hücre zarı içinde gömülü olan proteinler içerir. Transmembran proteinler bilinen proteinlerin% 30 üzerinde makyaj ve bugün kullanılan ilaçların büyük çoğunluğu için hedeflerdir. Transmembran proteinler yanlış katlama ya da etkinlik, kistik fibrozis ve diyabet gibi önemli genetik hastalıkların neden olur. Transmembran proteinler büyük önemi olmasına rağmen, çözünür proteinler için daha yapıları ve moleküler mekanizmaları hakkında çok az bilinen vardır. Hidrofobik dizilerinin varlığını zor bu proteinlerin büyük miktarlarda ifade ve izole etmek ve onları pek çok biyokimyasal ve yapısal yöntemler refrakter hale getirir.
Bu protokol bir MDR membran protein ifadesi, deterjan çözünürleştirme ve saflaştırma, çözünür protein deterjan kompleksi olarak gösterdi. Bu yöntemler çok recombinantly ifade transmembran proteinler için bazı değişiklikler ile birlikte kullanılabilir. Elde edilen saflaştırılmış protein deterjan kompleksleri çözünen ve X-ray kristal yapı tayini ve lipozomlar içine sulandırıldıktan veya çapraz bağlanma çalışmaları da dahil olmak üzere diğer biyofiziksel ve biyokimyasal karakterizasyonu, kristalizasyon denemeleri için kullanılabilir.
Arıtma işlemleri sırasında, protein deterjan kompleksleri spin konsantrasyon adımları sırasında çökelti olmadığını dikkatli olmak önemlidir. Önce veya sonra, çok küçük bir sütun ve küçük elüsyon hacmi ile IMAC adım tekrarlayarak gibi jel filtrasyon adım, PDC konsantre yardımcı olmak için farklı yöntemler de olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu proje, Ulusal Bilim Vakfı ve Biyomoleküler Bilimler Derneği CJJ hibe tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
