Summary
In dit protocol tonen we de uitdrukking, oplosbaar, en zuivering van een recombinant uitgedrukt membraaneiwit, MexB, als een oplosbare proteïne detergent complex. MexB is een multidrug resistance membraan transporter uit de opportunistische bacteriële pathogeen Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Multidrug resistentie (MDR), het vermogen van een kankercel of een ziekteverwekker bestand te zijn tegen een breed scala aan structureel en functioneel niets anti-kanker geneesmiddelen of antibiotica, is een actueel ernstig probleem in de volksgezondheid. Dit multidrug resistentie is grotendeels te wijten aan energie-afhankelijke drug efflux pompen. De pompen verdrijven anti-kanker medicijnen of antibiotica in de externe medium, het verlagen van de intracellulaire concentratie onder een toxische drempel. We bestuderen multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische bacteriële ziekteverwekker die infecties veroorzaakt bij patiënten met vele soorten blessures of ziekte, bijvoorbeeld brandwonden of cystic fibrose, en ook in immuno-gecompromitteerde kanker, dialyse en transplantatie patiënten. De belangrijkste MDR efflux pompen in P. aeruginosa zijn tripartiete complexen bestaan uit een binnenste membraan proton-drug antiporter (RND), een buitenste membraan kanaal (OMF), en een periplasmische linker eiwit (MFP) 1-8. De RND en de OMF eiwitten zijn transmembraan eiwitten. Transmembraan eiwitten te maken meer dan 30% van alle eiwitten en zijn 65% van de huidige drug targets. De hydrofobe transmembraan-domeinen maken de eiwitten onoplosbaar is in waterige buffer. Voordat een transmembraan eiwit kan worden gezuiverd, is het noodzakelijk te vinden buffer voorwaarden met een mild schoonmaakmiddel waarmee de op te lossen proteïne als een eiwit reinigingsmiddel complex (PDC) 9-11. In dit voorbeeld gebruiken we een RND eiwit, de P. aeruginosa MexB transmembraan vervoerder, om te demonstreren hoe een recombinante vorm van een transmembraan eiwit tot expressie, oplosbaar te maken met behulp van reinigingsmiddelen, en dan zuiveren het eiwit reinigingsmiddel complexen. Deze algemene methode kan worden toegepast op de expressie, zuivering, en het oplosbaar maken van vele andere recombinant uitgedrukt membraaneiwitten. Het eiwit reinigingsmiddel complexen kunnen later gebruikt worden voor biochemische of biofysische karakterisering waaronder X-ray kristalstructuur bepalen of verknoping studies.
Protocol
1. Dag 1:
MexB van Pseudomonas aeruginosa is gecodeerd door pFB101. De MexB gen werd geamplificeerd van P. aeruginosa genomisch DNA en ingebracht in de Ndel en Xhol restrictieplaatsen van de pET30b + vector. Het construct bevat een C-terminale hexahistidine tag.
- Het plasmide wordt gebruikt om E. te transformeren coli stam C43 (DE3) 12, en de transformanten worden uitgeplaat op LB-agar met 30 ug / ml kanamycine.
2. Dag 2: Overnachting Cultures:
- In de avond, zijn 4 x 3 ml LB kweken die 30 ug / ml kanamycine ingeënt uit de verse transformant koloniën. Als alternatief kan de culturen worden geënt vanaf een bevroren permanent.
Deze kleine culturen worden gekweekt op een rol bij 37 ° C gedurende de nacht.
3. Dag 3: Growing 6 Liter Cultures:
- In de ochtend, 's nachts gebruik maken van de culturen tot 150 ml LB met 30 ug / ml kanamycine inoculeren. Groeien de cultuur bij 37 ° C op een schudder.
- In de namiddag, gebruik maken van de kleine cultuur tot 6 x 1L 2XYT media die 30 ug / ml kanamycine in Fernbach kolven inoculeren. (Gebruik 25 ml per cultuur voor een 1:40 verdunning). Groeien de culturen bij 37 ° C tot ze bij een OD 600 van 0.4-0.6, ongeveer 1,5 uur
- Wanneer de culturen van de juiste dichtheid te bereiken, te induceren eiwitexpressie door het toevoegen van 0,5 ml 1M IPTG. Leg alle kolven in de shaker en blijven ze groeien bij 30 ° C gedurende de nacht.
4. Dag 4: Oogsten van cellen en zuiveren van het eiwit:
- Voeg proteaseremmers, DNAse, en lysozym de bufferoplossingen als volgt: tot 50 ml van de cel resuspensie buffer, voeg 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml eindconcentratie), een compleet EDTA-free protease remmer tablet, en een snufje van lysozym . Tot 60 ml van membraan resuspensie buffer, voeg een proteaseremmer tablet. Om een andere 50 ml van membraan resuspensie buffer, voeg een proteaseremmer tablet. Houd alle drie oplossingen op ijs.
- Centrifugeer de culturen 30 min 5000 rpm in de grootschalige centrifuge om de cellen te oogsten.
- Resuspendeer de cellen in 100 ml cel resuspensie buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, een compleet EDTA-free protease-remmer tablet, 0,1 mg / ml DNAse I, snufje van lysozym)
- Twee keer voorbij de cel oplossing door een Franse druk cel op 12.000 psi (762 overdruk). Verzamel de cellysaat in een fles bleef koud op het ijs.
- Breng de cellysaat om SS34 centrifuge en centrifugeer naar cel vuil te verwijderen gedurende 30 minuten bij 10.000 rpm bij 4 ° C in een SS-34 rotor.
- Verwijder voorzichtig het supernatant in Ti647.5 ultracentrifuge buizen. Centrifugeer 50 min bij 40000 rpm bij 4C. Giet het supernatans af.
- Resuspendeer de pellet, die de celmembranen bevat, in ca.. 25 ml membraan resuspensie buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, een complete EDTA-free protease remmer tablet).
- Breng de membraan schorsing een schone centrifugebuis en centrifugeer bij 40000 rpm in een Ti647.5 rotor voor 50 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de gewassen membraan pellet in 25 ml membraan resuspensie buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, een complete EDTA-free protease remmer tablet).
5. TM Protein Solublization:
- Om de geresuspendeerde membranen (ongeveer 25 ml), voeg 6 mL 10% DDM (laatste detergent concentratie = 2% DDM) Rock het mengsel bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugeer het mengsel bij 40.000 rpm gedurende 40 min bij 4 ° C in de Ti647.5 rotor om de oplosbare proteïne reinigingsmiddel complexen gescheiden van de onoplosbare eiwitten. Sla de supernatant, die de MexB eiwit detergent complexen bevat.
6. IMAC:
- Meng de supernatant verkregen uit de hoge snelheid draaien met de talon metalen kralen affiniteit geëquilibreerd in resuspensie buffer. Incubeer 1 uur op een rol bij 4 ° C.
- Giet de slurry in een zwaartekracht kolom lichaam en gooi het doorstromen.
- Was de kolom met 20 ml (10 kolomvolumes) van IMAC Binding en Wash Buffer (50 mM NAP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% DDM)
- Elueer het eiwit met IMAC elutiebuffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 250 mM imidazool, 0,2% DDM).
- Neem 15 pi monsters van de elutie fracties, meng elk met 15 pl 2X SDS sample buffer voor analyse door middel van polyacrylamidegelelektroforese. Spin 30sec in een microcentrifuge. Analyseer de monsters op een 10% polyacrylamide gel SDS om de hoeveelheid en de zuiverheid van MexB schatten in elke fractie.
- Zwembad de fracties die de MexB eiwit reinigingsmiddel complexen en zich te concentreren ze in een spin concentrator bij 4 ° C. Zorg ervoor dat het eiwit niet neer uit op deze stpe.
7. Gelfiltratie Column:
- Pre-equilibreren een Superose 12 HL 30/10 kolom met 24 ml lopen buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% beta-octylglucoside), en wacht op een vlakke basislijn.
- Spoel de Akta belasting van het systeem-lus met stromend buffer.
- Filter de eiwit-oplossing met behulp van een injectiespuit filter alvorens het aan de kolom.
- Plaats maximaal 240 pi van het eiwit-oplossing op de kolom, met een eiwit concentratie van maximaal 5 mg / ml.
- Run 1,5 kolomvolumes (36 ml) van de buffer, het verzamelen van 0,25 mL fracties. De MexB eiwit reinigingsmiddel complexen moeten elueren als een piek bij ongeveer 10 - 15 ml van elutie volume.
- Take 5 pi monsters van de piek fracties. Meng elk monster 1:1 met 2X SDS sample buffer. Analyseer de monsters op een 10% polyacrylamide gel om de hoeveelheid en de zuiverheid van MexB schatten in elke fractie
- Zwembad de fracties die pure MexB.
8. Representatieve resultaten:
Figuur 1 bevat een polyacrylamide gel met samengevoegde kolom fracties uit de IMAC kolom en de individuele fracties uit de gel filtratie kolom. Na de gelfiltratie kolom het eiwit lijkt zuiver Coomassie gekleurde polyacrylamide gel. Figuur 2 bevat een spoor uit de gel filtratie kolom waarin de belangrijkste piek van het eiwit reinigingsmiddel complex elueren uit de kolom. De gemiddelde opbrengst van MexB eiwit is ongeveer 2 mg per 6 liter 2XYT cultuur.
Figuur 1. SDS-PAGE gel van zuivering van MexB PDC's. Lane 1, Moleculair gewicht markers. 2, Gepoolde IMAC fracties. 3-7, Gel filtratie kolom fracties.
Figuur 2. Voorbeeld van gelfiltratie Resultaten voor MexB eiwit detergent complexen (PDC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In aanvulling op multidrug resistance, vele vitale cellulaire activiteiten, waaronder ion transport, cel-cel communicatie, blaasje transport, onderhoud van de cellulaire structuur, en de gastheer-pathogeen interacties, omvatten eiwitten die zijn ingebed in het celmembraan. Transmembraan eiwitten maken meer dan 30% van de bekende eiwitten en zijn de doelstellingen voor het merendeel van de geneesmiddelen in gebruik zijn. De ongeoorloofde vouwen of de activiteit van transmembraan eiwitten leiden tot belangrijke genetische ziekten, zoals cystic fibrosis en diabetes. Ondanks het enorme belang van transmembrane eiwitten, er is veel minder bekend over hun structuren en moleculaire mechanismen dan voor oplosbare eiwitten. De aanwezigheid van hydrofobe sequenties kan het moeilijk maken om te uiten en te isoleren grote hoeveelheden van deze eiwitten en maakt ze ongevoelig voor veel biochemische en structurele methoden.
Dit protocol aangetoond dat de uitdrukking, reinigingsmiddel oplosbaar en zuivering van een MDR membraaneiwit als een oplosbare proteïne detergent complex. Deze methoden kunnen gebruikt worden met enkele wijzigingen voor veel recombinant uitgedrukt transmembraan eiwitten. Het resulterende gezuiverde eiwit detergent complexen zijn oplosbaar en kan gebruikt worden voor kristallisatie trials voor X-ray kristallografische structuur vastberadenheid en voor andere biofysische of biochemische karakterisering, met inbegrip van reconstitutie in liposomen of verknoping studies.
Tijdens de zuivering procedures, is het belangrijk om voorzichtig te zijn dat eiwit reinigingsmiddel complexen niet neer tijdens de spin concentratie stappen. Verschillende methoden kunnen ook worden gebruikt om te helpen concentreren PDC voor of na de gel filtratie stap, zoals het herhalen van de IMAC stap met een zeer kleine kolom en kleine elutievolume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door subsidies aan CJJ van de National Science Foundation en de Vereniging voor Biomolecular Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
