Summary
在这个协议中，我们展示的表达，增溶，并纯化了重组表达的膜蛋白，MexB，作为一种可溶性蛋白的洗涤剂复杂。 MexB是机会主义的细菌病原体绿脓杆菌多药耐药膜转运。
Abstract
多药耐药（MDR），一个癌细胞或病原体的能力，可耐广泛的结构和功能无关的抗癌药物或抗生素，是当前公众健康的严重问题。这多药耐药性，很大程度上是由于能源的依赖性药物外排泵。该泵排出到外部介质的抗癌药物或抗生素，降低其细胞内浓度有毒的阈值以下。我们正在研究一种投机取巧的细菌病原体，导致受伤或生病的种类很多患者感染绿脓杆菌，多药耐药性，例如，烧伤或囊肿性纤维化，也免疫能力受损的癌症，透析，移植患者。主要的多药耐药外排泵在 P. 绿脓杆菌是内膜药物质子逆向转运（RND），外膜通道（OMF），和周质连接器蛋白（MFP）1-8组成的三方配合物。 RND和OMF蛋白质跨膜蛋白。跨膜蛋白弥补所有的蛋白质超过30％和65％，目前的药物靶标。疏水跨膜结构域的蛋白质不溶于水缓冲。之前可纯化的一种跨膜蛋白，它是要找到缓冲液，含有温和的清洁剂，使蛋白质溶解作为一种蛋白质洗涤剂复合体（PDC） 9-11。在这个例子中，我们使用一个RND的蛋白质， 在体育铜绿 MexB跨膜转运，向人们展示如何重组的形式表达了一种跨膜蛋白，溶解，使用洗涤剂，然后净化的蛋白质洗涤剂复合物。这是一般的方法可以应用到的表达，纯化，和许多其他重组表达的膜蛋白的溶解。可以在以后的蛋白质洗涤剂复合物用于生化或生物物理特性，包括X -射线晶体结构测定或交联的研究。
Protocol
1。第1天：
MexB 绿脓杆菌是由pFB101编码。从P. MexB基因扩增绿脓杆菌基因组DNA和NdeI和XhoI位的pET30b +载体的酶切位点插入。该结构包含一个C -末端hexahistidine标签。
- 质粒是用于转化大肠杆菌菌株 C43（DE3）12，并转化镀上含有30微克/ mL卡那霉素的LB琼脂。
2。第2天：过夜培养：
- 到了晚上，4 × 3毫升LB培养基培养，含有30微克/ mL卡那霉素是从新鲜的转化菌落接种。另外，文化可以从冷冻烫发接种。
这些小的文化是生长在一个滚轴在37℃过夜。
3。第3天：种植6升文化：
- 在早晨，利用过夜培养，接种150毫升含30微克/ mL卡那霉素的LB。增长在37 ° C在摇床的文化。
- 当天下午，用小文化接种6 × 1L 2XYT媒体，含有30微克/毫升费恩巴赫烧瓶中的卡那霉素。 （使用1:40稀释为25％毫升文化）。成长的文化，在37 ° C，直到他们达到了0.4-0.6 外径 600约1.5小时，
- 当文化达到适当的密度，加入0.5 ml 1M IPTG诱导蛋白表达。把所有的烧瓶在摇床，并继续增长，他们在30 ° C过夜。
4。第4天：收获的细胞和净化蛋白质：
- 添加蛋白酶抑制剂，DNA酶，溶菌酶缓冲的解决方案如下：50 mL的细胞再悬浮液，添加10毫克DNaseI（终浓度为0.1毫克/毫升），1完成EDTA无蛋白酶抑制剂的片剂，溶菌酶捏。膜再悬浮缓冲液为60毫升，加1蛋白酶抑制剂片。另一种膜再悬浮缓冲液50毫升，加1蛋白酶抑制剂片。置于冰上所有三种解决方案。
- 离心机的文化30分钟大型离心机5000 rpm到收获细胞。
- 重悬的细胞，细胞再悬浮在100 mL缓冲液（MgCl 2的2毫米，300毫米氯化钠，pH值7.0，50 mM的午睡，1完成EDTA无蛋白酶抑制剂片，0.1毫克/毫升DNA酶我，掐溶菌酶）
- 通过在法国的压力12,000 PSI（762表压）细胞，通过细胞溶液两次。在一个瓶子收集细胞裂解液在冰上保持低温。
- 细胞裂解液转移到SS34离心管，离心去除10,000 rpm的细胞碎片，为30分钟，在4 °在SS - 34转子彗星。
- 小心取出上清液Ti647.5超速离心机管。离心50分钟40,000 RPM 4C。上清液。
- 悬浮颗粒，其中包含约细胞膜。膜再悬浮缓冲液25毫升（300毫米氯化钠，pH值7.0，50 mM的午睡，5％甘油，1完成EDTA无蛋白酶抑制剂平板）。
- 转让Ti647.5转子在50分钟40,000 RPM膜悬浮到一个干净的离心管和离心4 ° C。
- 弃上清，悬浮于25 mL膜再悬浮缓冲液洗膜颗粒（300毫米氯化钠，pH值7.0，50 mM的午睡，5％甘油，1完成EDTA无蛋白酶抑制剂片）。
5。 TM蛋白Solublization：
- 悬浮膜（约25毫升），加6毫升10％的DDM（最后的洗涤剂浓度= 2％的DDM）岩石的混合物在4 ° C为2小时。
- 4时40分，40000 RPM离心混合物° C的Ti647.5转子分开不溶性蛋白质复合物的可溶性蛋白质洗涤剂。保存上清，其中包含MexB的蛋白质洗涤剂复合物。
6。 IMAC：
- 混合爪金属亲和珠在再悬浮缓冲液平衡的高速旋转取上清。孵育1小时上辊在4 ° C。
- 浆料倒入一个重力流柱身和丢弃的流量通过。
- 洗净，用20 mL iMac的绑定和洗涤缓冲液（10个柱体积）（300毫米氯化钠，pH值7，50 mM的午睡，5％甘油，0.2％的DDM）列
- 洗脱IMAC洗脱缓冲液（300毫米氯化钠，pH值7.0，50 mM的午睡，5％甘油，250毫米咪唑，0.2％的DDM）的蛋白质。
- 取15μL的洗脱组分样品，每15μL的2X SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品缓冲液混合。在离心旋转30秒。分析对10％的聚丙烯酰胺SDS凝胶样本，估计在每个分数MexB的数量和纯度。
- 池的分数包含的MexB的蛋白质洗涤剂复合物，他们集中在一个旋转集中在4 ° C的小心，蛋白质不沉淀在这个STEP。
7。凝胶过滤柱：
- 预平衡一个Superose 12 30/10列HL 24毫升运行缓冲液（300毫米氯化钠，pH值7.0，50 mM的午睡，5％甘油，0.2％β- octylglucoside），并等待一个单位的基准。
- 运行缓冲液冲洗阿克达系统加载循环。
- 过滤蛋白质溶液用注射器过滤器，然后将它应用到列。
- 负载可达240μL蛋白溶液列上的蛋白浓度，毫克/毫升。
- 运行1.5倍柱体积的缓冲液（36毫升），收取0.25毫升的分数。 MexB的蛋白质洗涤剂复合物洗脱高峰在大约10 - 15毫升洗脱体积。
- 取5μL高峰分数样品。 2X SDS样品缓冲液混合，每个样品1:1。 10％的聚丙烯酰胺凝胶分析的样品，估计在每一个分数的数量和纯度MexB
- 池的分数包含纯MexB。
8。代表性的成果：
图1包括一个从IMAC柱和凝胶过滤柱的个人分数汇集列分数的聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质的凝胶过滤柱后出现纯粹的考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。图2包括从凝胶过滤列显示的蛋白质洗涤剂列复杂的洗脱主峰的痕迹。 MexB蛋白质的平均收益率大约为2毫克每6公升2XYT文化。
图1。 SDS - PAGE电泳凝胶MexB PDC的净化。弄1，分子量标记。 2，公摊IMAC分数。 3-7，凝胶过滤柱分数。
图2。凝胶过滤结果MexB的蛋白质洗涤剂复合物（PDC）上的例子。
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Discussion
此外，多药阻力，许多重要的细胞活动，包括离子转运，细胞与细胞间的沟通，囊泡运输，细胞结构的维修，和宿主 - 病原体相互作用，涉及嵌入细胞膜的蛋白质。跨膜蛋白已知的蛋白质超过30％，是在今天使用的药品大多数的目标。折叠或不当的跨膜蛋白的活性，导致重要的遗传性疾病，包括囊肿性纤维化和糖尿病。尽管广大的跨膜蛋白重要性，远不比可溶性蛋白已知其结构和分子机制。疏水序列的存在可以使其难以表达和分离这些蛋白质的大量和许多生化和结构的方法使他们难治。
此协议表明作为一种可溶性蛋白的洗涤剂复杂MDR膜蛋白的表达，清洁剂的增溶和净化。这些方法可用于许多重组表达的跨膜蛋白做一些修改。由此产生的纯化的蛋白质洗涤剂复合物的水溶性和可用于X射线晶体结构测定和其他生物物理或生化特性，其中包括重建成脂质体或交联的研究结晶试验。
在纯化过程中，重要的是要小心，蛋白质去污剂复合物不沉淀在旋转浓缩步骤。不同的方法也可能用于帮助集中凝胶过滤的步骤，如重复一个非常小柱和洗脱体积小的iMac的一步，之前或之后的PDC。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这个项目是由来自美国国家科学基金会和生物分子科学协会的资助，以CJJ支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
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