Summary
In diesem Protokoll zeigen wir den Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung von rekombinant exprimierten Membranprotein, MexB, wie ein lösliches Protein Waschmittel komplex. MexB ist ein Multidrug-Resistenz-Membran-Transporter aus der opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Multidrug Resistenz (MDR), die Fähigkeit einer Krebszelle oder Erreger eine Resistenz gegen ein breites Spektrum von strukturell und funktionell unabhängigen Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika, ist eine aktuelle ernstes Problem im öffentlichen Gesundheitswesen. Das Multidrug-Resistenz ist vor allem auf Energie-abhängigen Efflux-Pumpen. Die Pumpen vertreiben Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika in den externen Datenträger, senken ihre intrazelluläre Konzentration unterhalb einer toxischen Schwelle. Wir untersuchen Multidrug-Resistenz in Pseudomonas aeruginosa, eine opportunistische bakterielle Erreger, die Infektionen verursachen bei Patienten mit vielen Arten von Verletzungen oder Krankheit, z. B. Verbrennungen oder zystische Fibrose, und auch bei immungeschwächten Krebs, Dialyse und Transplantation Patienten. Die wichtigsten MDR Effluxpumpen in P. aeruginosa sind dreigliedrige Komplexe aus einer inneren Membran Proton-Medikament Antiporters (RND), eine äußere Membran-Kanal (OMF) und eine periplasmatische Linker Protein (MFP) 1-8 zusammen. Die RND-und OMF-Proteine sind Transmembranproteine. Transmembranproteine machen mehr als 30% aller Proteine und sind 65% der aktuellen Wirkstoff-Targets. Die hydrophoben Transmembrandomänen machen die Proteine unlöslich in wässrigen Puffern. Bevor ein Transmembranprotein gereinigt werden kann, ist es notwendig, Puffer-Bedingungen mit einem milden Reinigungsmittel, dass das Protein als ein Protein Waschmittel-Komplex (PDC) 9-11 gelöst werden können zu finden. In diesem Beispiel verwenden wir eine RND Protein, das P. aeruginosa MexB Transmembran-Transporter, um zu zeigen, wie man eine rekombinante Form eines Transmembran-Protein exprimieren, lösen sie mit Hilfe von Detergenzien und dann reinigen das Protein Waschmittel-Komplexen. Diese Methode kann die Expression, Reinigung und Solubilisierung von vielen anderen rekombinant exprimierten Membranproteinen angewandt werden. Das Protein Waschmittel-Komplexe können später für biochemische oder biophysikalische Charakterisierung einschließlich X-ray Kristallstrukturbestimmung oder Vernetzung Studien verwendet werden.
Protocol
1. Tag 1:
MexB von Pseudomonas aeruginosa wird durch pFB101 kodiert. Die MexB Gen wurde aus P. verstärkt aeruginosa genomische DNA und in die NdeI und XhoI Restriktionsschnittstellen des pET30b + Vektor. Das Konstrukt enthält einen C-terminalen Hexa-Histidin-tag.
- Das Plasmid wird verwendet, um E. verwandeln coli-Stamm C43 (DE3) 12, und die Transformanten auf LB Agar mit 30 ug / mL Kanamycin.
2. Tag 2: Nacht-Kulturen:
- Am Abend sind 4 x 3 ml LB-Kulturen mit 30 ug / mL Kanamycin aus der frischen Transformante Kolonien beimpft. Alternativ können die Kulturen aus einem gefrorenen perm geimpft werden.
Diese kleinen Kulturen sind auf einer Walze bei 37 ° C über Nacht gewachsen.
3. Tag 3: Growing 6 Liter Cultures:
- Am Morgen, verwenden Sie den Nacht-Kulturen auf 150 mL LB mit 30 ug / mL Kanamycin impfen. Die Kultur bei 37 ° C auf einem Schüttler.
- Am Nachmittag, verwenden Sie die kleine Kultur zu 6 x 1L 2xYT Medien mit 30 ug / ml Kanamycin in Fernbach-Kolben zu impfen. (Verwenden Sie 25 ml pro Kultur für eine 1:40-Verdünnung). Wachsen die Kulturen bei 37 ° C bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,4-0,6, ca. 1,5 Stunden
- Wenn die Kulturen der richtigen Dichte zu erreichen, induzieren die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mL 1M IPTG. Legen Sie alle Flaschen zurück in den Shaker geben und sie weiterhin bei 30 ° C über Nacht wachsen.
4. Tag 4: Die Ernte von Zellen und Reinigen des Proteins:
- Add-Protease-Inhibitoren, DNAse und Lysozym auf die Pufferlösungen wie folgt: Zu 50 mL der Zelle Resuspensionspuffer, 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml Endkonzentration), 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette und eine Prise von Lysozym . Um 60 ml Membran Resuspensionspuffer, fügen Sie 1 Protease-Inhibitor Tablette. Um weitere 50 ml Membran Resuspensionspuffer, fügen Sie 1 Protease-Inhibitor Tablette. Halten Sie alle drei Lösungen auf Eis.
- Centrifuge die Kulturen 30 min 5.000 Umdrehungen in großen Zentrifuge, um die Zellen zu ernten.
- Resuspendieren der Zellen in 100 mL Zelle Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor Tabletten, 0,1 mg / ml DNase I, Prise Lysozym)
- Pass der Zelle Lösung zweimal durch eine Französisch Druckzelle bei 12.000 psi (762 Überdruck). Sammeln Sie die Zelllysat in eine Flasche auf Eis gehalten kalt.
- Übertragen Sie die Zelllysat auf SS34 Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge, um Zelltrümmer für 30 min entfernt bei 10.000 rpm bei 4 ° C in einem SS-34 Rotor.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand in Ti647.5 Ultrazentrifuge Röhren. Zentrifuge 50 min bei 40.000 rpm bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
- Das Pellet, das die Zellmembranen enthält, in ca.. 25 mL der Membran Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette).
- Übertragen Sie die Membran-Suspension, um eine saubere Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 40.000 rpm in einem Ti647.5 Rotor für 50 min bei 4 ° C.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet gewaschen Membran in 25 mL Membran Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette).
5. TM Protein Solublization:
- Um die resuspendierten Membranen (ca. 25 ml), 6 mL 10% DDM (final Detergenskonzentration = 2% DDM) Rock die Mischung bei 4 ° C für 2 Stunden.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 40.000 rpm für 40 min bei 4 ° C in der Ti647.5 Rotor das lösliche Protein Waschmittel-Komplexe von den unlöslichen Proteinen zu trennen. Speichern Sie die Überstand, der die MexB Protein-Komplexen Reinigungsmittel enthält.
6. IMAC:
- Mix der Überstand aus dem High-Speed-Spin mit dem Talon Metall Affinität Perlen äquilibriert in Resuspensionspuffer erhalten. Inkubieren für 1 Stunde auf einer Walze bei 4 ° C.
- Gießen Sie die Gülle in einen Fließbecher Spalte Körper und entsorgen Sie die Durchströmung.
- Die Säule wird mit 20 mL (10 Säulenvolumen) von IMAC Binding und Waschpuffer (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,2% DDM)
- Eluieren des Proteins mit IMAC-Elutionspuffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 250 mM Imidazol, 0,2% DDM).
- Nehmen Sie sich 15 ul Proben der Elutionsfraktionen, Mix mit je 15 ul 2X SDS-Probenpuffer für die Analyse durch Gelelektrophorese. Spin 30sec in einer Mikrozentrifuge. Analysieren Sie die Proben auf einem 10% Polyacrylamid-SDS-Gel, um die Menge und Reinheit des MexB in jeder Fraktion zu schätzen.
- Pool der Fraktionen, die die MexB Protein-Komplexen Waschmittel und konzentrieren sie in einem Spin-Konzentrator bei 4 ° C. Achten Sie darauf, dass das Protein nicht ausfällt bei dieser step.
7. Gelfiltrationssäule:
- Pre-Gleichgewicht einer Superose 12 HL 30/10 Säule mit 24 ml Laufpuffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,2% beta-Octylglucosid), und warten Sie auf eine flache Basislinie.
- Spülen Sie den Akta Systembelastung Schleife mit Laufpuffer.
- Filtern Sie die Protein-Lösung mit einer Spritze Filter vor dem Auftragen auf die Säule.
- Legen Sie bis zu 240 &mgr; l der Proteinlösung auf die Säule, mit einer Proteinkonzentration von bis zu 5 mg / mL.
- Run 1,5 Säulenvolumen (36 ml) Puffer, sammeln 0,25 ml-Fraktionen. 15 ml Elutionsvolumen - Die MexB Protein-Komplexen Waschmittel sollte als ein Peak bei ca. 10 eluieren.
- Take 5 ul Proben der Peak-Fraktionen. Mix jede Probe 1:1 mit 2X SDS-Probenpuffer. Analysieren Sie die Proben auf einem 10% Polyacrylamidgel, um die Menge und Reinheit des MexB in jeder Fraktion Schätzung
- Pool der Fraktionen, die reines MexB.
8. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1 enthält eine Polyacrylamidgel mit gepoolten Spalte Fraktionen aus der IMAC-Säule und einzelnen Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule. Nach der Gelfiltrationssäule das Protein scheint pure durch Coomassie gefärbten Polyacrylamidgel. Abbildung 2 enthält eine Spur von der Gelfiltrationssäule, die die wichtigsten Gipfel des Proteins Reinigungsmittel komplexen eluting aus der Säule. Der durchschnittliche Ertrag von MexB Protein ist etwa 2 mg pro 6 Liter 2xYT Kultur.
Abbildung 1. SDS-PAGE-Gel der Reinigung von MexB PDCs. Lane 1, Molekulargewichtsmarker. 2, IMAC Fraktionen gepoolt. 3-7, Gelfiltrationssäule Fraktionen.
Abbildung 2. Beispiel Gelfiltration Ergebnisse für MexB Protein Waschmittel-Komplexe (PDC).
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Discussion
Neben Multidrug-Resistenz, viele lebenswichtige zelluläre Aktivitäten, einschließlich Ionentransport, Zell-Zell-Kommunikation, Vesikeltransport, Wartung der zellulären Struktur und Wirt-Pathogen-Interaktionen beinhalten Proteine, die in die Zellmembran eingebettet sind. Transmembranproteine machen über 30% der bekannten Proteine und sind die Ziele für die Mehrheit der Medikamente heute im Einsatz. Die unsachgemäße Faltung oder Aktivität des Transmembranproteine führen wichtige genetische Krankheiten, darunter Mukoviszidose und Diabetes. Trotz der großen Bedeutung der Transmembranproteine, es ist weit weniger bekannt über ihre Strukturen und molekulare Mechanismen als für lösliche Proteine. Die Anwesenheit von hydrophoben Sequenzen können es schwierig machen, auszudrücken und zu isolieren, große Mengen dieser Proteine und macht sie refraktär vielen biochemischen und strukturellen Methoden.
Dieses Protokoll zeigt den Ausdruck, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung eines MDR-Protein als ein lösliches Protein Waschmittel komplex. Diese Methoden können mit einigen Änderungen für viele rekombinant exprimiert Transmembranproteine verwendet werden. Das gereinigte Protein Waschmittel-Komplexe sind löslich und können für die Kristallisation Studien für röntgenographische Strukturbestimmung und für andere biophysikalischen oder biochemischen Charakterisierung, einschließlich Rekonstitution in Liposomen oder Vernetzung Studien verwendet werden.
Während der Reinigung Verfahren ist es wichtig, vorsichtig zu sein, dass Protein-Komplexen Waschmittel nicht ausfallen während der Spin-Konzentration Schritte. Verschiedene Methoden können auch verwendet werden, um zu einer Bündelung der PDC vor oder nach dem Gelfiltrationsschritt, wie wiederholte die IMAC Schritt mit einem sehr kleinen Spalten und kleine Elutionsvolumen werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse zu CJJ von der National Science Foundation und der Gesellschaft für Biomolekulare Wissenschaften unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
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