Summary
このプロトコルでは、可溶性タンパク質の洗浄剤複合体として、発現、可溶化、および組換え的に発現する膜蛋白質、MexBの精製を示す。 MexBは日和見細菌性病原体は緑膿菌からの多剤耐性膜輸送体である。
Abstract
多剤耐性（MDR）、構造的および機能的に関係のない抗がん剤や抗生物質の広い範囲に耐性であることが癌細胞や病原体の能力は、公衆衛生の現在の深刻な問題です。この多剤耐性がエネルギー依存性の薬剤排出ポンプによるところが大きい。ポンプは、毒性閾値以下にそれらの細胞内濃度を下げる、外部媒体への抗がん剤や抗生物質を排出する。我々は、 緑膿菌 、例えば、怪我や病気の多くのタイプの患者に感染症を引き起こす日和見細菌性病原体、火傷や嚢胞性線維症では、とにも免疫不全のがん、透析、および移植患者における多剤耐性を検討している。 P.における主要なMDRの排出ポンプ緑膿菌は、内膜プロトン-薬物アンチポーター（RND）、外膜のチャネル（OMF）、およびペリプラズムリンカー蛋白質（MFP）1-8から成る三者複合体である。 RNDとOMFタンパク質は、膜貫通蛋白質である。膜貫通型タンパク質は、全てのタンパク質の30％以上を構成し、現在の創薬ターゲットの65％です。疎水性の膜貫通ドメインは、水性緩衝液中のタンパク質が不溶性にします。膜貫通タンパク質を精製することができる前に、それは蛋白質が蛋白質の界面活性剤複合体（PDC）9月11日として可溶化できるように中性洗剤を含む緩衝条件を発見することが必要である。この例では、我々はRNDタンパク質、P.を使用してください、膜貫通タンパク質の組換え形態を表現洗剤を使用して、それを可溶化し、タンパク質の界面活性剤の複合体を精製する方法を示す緑膿菌の MexB貫通型トランスポーター、。この一般的な方法は、発現、精製、および他の多くの組換え的に発現する膜タンパク質の可溶化に適用することができます。タンパク質の洗剤の複合体は、後にX線結晶構造決定や架橋の研究を含む生化学的または生物物理学的特性評価に使用することができます。
Protocol
1。 1日目：
緑膿菌からMexBはpFB101によってエンコードされます。 MexB遺伝子は、P.から増幅された緑膿菌ゲノムDNAおよびpET30b +ベクトルのNdeI及びXhoI制限部位に挿入。構造はC末端ヘキサヒスチジンタグが含まれています。
- プラスミドを大腸菌を形質転換するのに使用され大腸菌は、C43（DE3）12株、および形質転換体を30 ug / mlとカナマイシンを含むLB寒天上にプレーティングされています。
2。 2日目：一晩培養：
- 夕方には、30 ug / mlとカナマイシンを含む4 X 3 mlのLB培養液は、新鮮な形質転換体のコロニーから接種されています。また、培養は、凍結パーマから接種することができます。
これらの小さな文化は37℃で一晩ローラー上に成長されています。
3。 3日目：6リットルの文化を育てる。
- 午前中は、30 ug / mlとカナマイシンを含む150mLのLBに接種するのに一晩培養を使用してください。 37シェーカー上で° Cで培養して成長する。
- 午後には、フェルンバッハのフラスコで30 ug / mlとカナマイシンを含む6 × 1L 2XYTメディアを接種する小さな文化を使う。 （1:40希釈用培養液あたり25mlを使用してください）。 37の文化を育て° Cを彼らが0.4から0.6のOD 600に到達するまで、1.5時間程度
- 培養物は、適切な密度に達すると、0.5mLの1M IPTGを添加することによりタンパク質の発現を誘導する。シェーカーに戻ってすべてのフラスコに入れ、℃で一晩30℃、それらを成長を続けている。
4。 4日目：細胞を採取し、タンパク質を精製する。
- 次のように、緩衝液にプロテアーゼ阻害剤、DNアーゼ、およびリゾチームを追加する：細胞の再懸濁バッファー50mlに、10mgのDNaseI（0.1 mg / mLの最終濃度）、リゾチームの1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤のタブレット、とピンチを追加します。 。膜の再懸濁バッファー60 mLに、1プロテアーゼ阻害剤のタブレットを追加する。膜の再懸濁バッファーの別の50 mLに、1プロテアーゼ阻害剤のタブレットを追加する。氷の上ですべての3つのソリューションをしてください。
- 細胞を回収するために大規模な遠心分離機の文化30分5,000 rpmで遠心する。
- 100 mLの細胞を再懸濁バッファーに懸濁し（50 mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、2mMのMgCl 2、1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤のタブレット、リゾチームのは0.1 mg / mlのDNase I、ピンチ）
- 12000 PSI（762ゲージ圧）でフレンチ圧力セルを2回細胞溶液を渡します。瓶の中に細胞ライセートを収集するには、氷の上に冷たいまま。
- SS34遠心チューブに細胞溶解液を移し、4℃、10,000 rpmで30分間細胞破片を除去するため遠心° CのSS - 34ローターで。
- 慎重にTi647.5超遠心チューブに上清を取り除く。 4Cで40,000 rpmで50分間遠心操作する。上清を捨てる。
- 約で、細胞膜を含むペレットを、懸濁します。膜の再懸濁バッファーを25mL（50 mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤の錠剤）。
- 4℃で50分間Ti647.5ローターで40,000 rpmで遠心チューブと遠心分離機℃に膜懸濁液を移す
- 上清を捨て、25mLの膜の再懸濁バッファー（50mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、1コンプリートEDTA -フリープロテアーゼ阻害剤の錠剤）で洗浄した膜ペレットを再懸濁します。
5。 TMタンパク質Solublization：
- 再懸濁した膜（25mLを約）に、6 mLの10％DDM（最後の界面活性剤濃度= 2％DDM）ロック4で混合℃で2時間。を追加する
- 4℃で40分間40,000 rpmで混合物を遠心° C不溶性の蛋白質から可溶性タンパク質の界面活性剤複合体を分離するTi647.5ローターインチMexBタンパク質の洗剤の複合体を含む上清を、保存します。
6。 IMAC：
- 再懸濁バッファーで平衡化した爪の金属アフィニティービーズで高速回転から得られた上清を混ぜる。 4でローラーで1時間インキュベート℃に
- 重力流カラム本体にスラリーを注ぎ、フロースルーを捨てる。
- IMAC結合および洗浄バッファー（50 mMリンNAP、pH7で、300mMのNaCl、5％グリセロール、0.2％DDM）を20mL（10カラム体積）でカラムを洗浄
- IMAC溶出バッファー（50mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、250 mMイミダゾール、0.2％DDM）でタンパク質を溶出する。
- 溶出画分15μLのサンプルを取る、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析のために15μL2X SDSサンプルバッファーでそれぞれを混ぜる。微量遠心機で30秒を回転させる。各分画でMexBの量と純度を推定するために10％ポリアクリルアミドSDSゲル上でサンプルを分析する。
- MexBタンパク質の洗剤の複合体と4でスピンコンセントレータでそれらを集中を含む画分をプール℃のタンパク質がこのsで沈殿しないように注意してくださいTEP。
7。ゲル濾過カラム：
- 24 mlのランニングバッファー（50 mMのNAPは、pH 7.0、300mMのNaCl、5％グリセロール、0.2％β-オクチルグルコシド）とスーパーローズ12 HL 10分の30の列をあらかじめ平衡化し、フラットなベースラインを待ちます。
- バッファを実行するとループをロードするAKTAシステムをすすぎます。
- 列に適用する前に、シリンジフィルターを用いてタンパク質溶液をフィルタ。
- 5mgの/ mLまでのタンパク質濃度で、カラムにタンパク質溶液240μLまで原稿をセット。
- バッファの1.5カラム体積（36 mL）を実行する、0.25 mLの画分を集めた。溶出量を15mL - MexBタンパク質の洗剤の複合体は、約10のピークとして溶出してください。
- ピーク画分の5μLのサンプルを取る。 2X SDSサンプルバッファーで各サンプル1:1に混ぜる。各分画でMexBの量と純度を推定するために10％ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを分析する
- 純粋MexBを含む画分プール。
8。代表的な結果：
図1は、ゲル濾過カラムからのIMACカラムと個々の画分からプールされたカラムの分画とポリアクリルアミドゲルを含んでいる。ゲル濾過カラムの後にタンパク質はクマシー染色したポリアクリルアミドゲルで純粋に表示されます。図2は、カラムからのタンパク質の洗剤複雑な溶出の主要なピークを示すゲル濾過カラムからのトレースが含まれます。 MexBタンパク質の平均収量は2XYT文化6リットルあたり約2ミリグラムです。
図1。 MexBのPDCの精製のSDS - PAGEゲル。レーン1、分子量マーカー。 2、IMACの画分をプールされた。 3-7、ゲルろ過カラムの分画。
図2。 MexBタンパク質の洗剤の複合体（PDC）用のゲルろ過の結果の例。
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Discussion
多剤耐性に加えて、イオン輸送、細胞間コミュニケーション、小胞輸送、細胞構造の維持、および宿主 - 病原体相互作用を含む多くの重要な細胞活動は、細胞膜に埋め込まれているタンパク質を含む。膜貫通型タンパク質は、既知のタンパク質の30％以上を構成し、今日使用されている医薬品の大半の目標です。膜貫通型タンパク質の不適切な折りたたみや活動は、嚢胞性線維症や糖尿病などの重要な遺伝病につながる。膜貫通型タンパク質の広大な重要性にもかかわらず、可溶性タンパク質に比べてその構造と分子機構に関するこれまであまり知られています。疎水性配列の存在は、それが難しいこれらのタンパク質の大量を表現し、分離することと、多くの生化学的及び構造方法へのそれらは、難治性ですできます。
このプロトコルは、可溶性タンパク質の界面活性剤複合体としてMDRの膜タンパク質の発現、界面活性剤可溶化および精製を示した。これらのメソッドは、多くの組換えにより発現さの膜貫通タンパク質のいくつかの変更で使用することができます。結果として得られる精製されたタンパク質の界面活性剤複合体は可溶性であり、リポソームまたは架橋の研究への再構成を含めて、X線結晶構造決定のため及び他の生物物理学的または生化学的特性評価のための結晶化試験に使用することができます。
精製操作中に、タンパク質の界面活性剤複合体は、スピン濃度のステップ中に沈殿しないように注意することが重要です。別の方法はまた、非常に小さな列と小さい溶出容量とIMACのステップを繰り返すように、ゲル濾過工程の前または後にPDCを集中するために使用される場合があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、全米科学財団と生体分子科学学会からCJJへの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
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