Summary
이 프로토콜에서 우리는 가용성 단백질 세제 복합으로 표현, solubilization, 그리고 recombinantly 표현 막 단백질, MexB의 정화를 보여줍니다. MexB는 기회 세균성 병원체 녹농균에서 multidrug 저항 막 수송이다.
Abstract
Multidrug 저항 (MDR), 구조적 및 기능적으로 관련이없는 안티 - 암 약물이나 항생제의 다양한 내성이 될 수있는 암 세포 또는 병원체의 능력이, 공중 보건의 현재의 심각한 문제입니다. 이 multidrug 저항은 에너지 의존 약물 유출 펌프에 크게 때문입니다. 펌프는 독성이 임계값 아래에 자신의 세포 농도를 낮추고, 외부 매체에 방지 암 약물이나 항생제를 추방. 우리는 예를 들어, 화상 또는 낭성 섬유증, 또한 단백질 손상 암, 투석과 이식 환자에서 녹농균, 부상 또는 질병의 많은 종류의 환자에서 감염을 일으키는 기회 세균 병원체에 multidrug 저항을 연구하고있다. P.의 주요 MDR의 유출 펌프 녹농균이라는 박테리아는 내부 멤브레인 프로톤 - 약물 antiporter (RND), 외부 멤브레인 채널 (OMF) 및 periplasmic 링커 단백질 (MFP) 1-8 구성되어 삼자 간의 단지입니다. RND 및 OMF 단백질 transmembrane 단백질입니다. Transmembrane 단백질은 모든 단백질의 30 % 이상을 구성하고 현재의 약물 타겟의 65 %입니다. 소수성 transmembrane 도메인은 수성 버퍼에 단백질이 불용성합니다. transmembrane 단백질을 정화하기 전에, 그것은 단백질이 단백질 세제 단지 (PDC) 9-11로 solubilized 수 있도록 가벼운 세제를 포함하는 버퍼 조건을 찾을 필요가 있습니다. 이 예제에서, 우리는 RND 단백질, P.을 사용 , transmembrane 단백질의 재조합 형태로 표현이 세제를 사용 solubilize 다음 단백질 세제 단지를 정화하는 방법을 보여주는 녹농균이라는 박테리아의 MexB의 transmembrane 수송. 이것은 일반적인 방법은 표현, 정화 및 기타 여러 recombinantly 표현 막 단백질의 solubilization 적용할 수 있습니다. 단백질 세제 단지는 나중에 X - 선 결정 구조의 결정이나 crosslinking 연구를 포함한 생화 학적 또는 biophysical 특성화 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 1 일 :
녹농균의 MexB는 pFB101에 의해 인코딩됩니다. MexB 유전자가 증폭되었다 P.부터 녹농균이라는 박테리아의 게놈의 DNA와 NdeI과 pET30b + 벡터의 XhoI 제한 사이트에 삽입. 구조는 C - 터미널 hexahistidine 태그를 포함하고 있습니다.
- 플라스미드가 E.을 변환하는 데 사용됩니다 대장균은 C43 (DE3) 12 변형율과 transformants 30 UG / ML kanamycin이 포함된 LB 한천에 도금입니다.
2. 일 2 : 숙박 문화 :
- 저녁에는, 30 UG / ML kanamycin이 포함된 4 X 3 ML의 LB 문화는 신선한 transformant의 식민지에서 주사를하고 있습니다. 또는 문화가 얼어 파마에서 주사 수 있습니다.
이러한 작은 문화가 ° C 야간 37 롤러에 성장하고 있습니다.
3. 3 일 : 6 리터 문화를 성장 :
- 아침에, 30 UG / ML kanamycin을 포함한 150 ML의 LB를 예방하기 위해 야간 문화를 사용합니다. 37 흔드는에서 ° C에서 문화를 성장.
- 오후에는, 30 UG / Fernbach의 flasks의 ML의 kanamycin이 포함된 6 X 1L 2XYT 미디어를 예방하기 위해 작은 문화를 사용합니다. (1시 40분 희석을위한 문화 당 25 ML을 사용합니다.) 37 문화를 성장 ° C들은 1.5 시간 약 0.4-0.6의 OD 600에 도달할 때까지
- 문화가 적절한 밀도에 도달하면, 0.5 ML 1M IPTG를 추가하여 단백질 발현을 유도. 쉐이크에 다시 모든 flasks을 넣고 ° C 야간 30 그들을 계속 성장하고 있습니다.
4. 일 4 : 전지를 착취하고 단백질을 퓨리화잉 :
- 다음과 같이 버퍼 솔루션 테아제 억제제, DNAse하고, 라이 소 자임 추가 : 셀 resuspension 버퍼 50 ML하기 위해, 10 MG DNaseI (0.1 MG / ML 최종 농도), 라이 소 자임 1 완전한 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제의 정제 및 핀치를 추가 . 막 resuspension 버퍼 60 ML 위해 1 테아제 억제제의 정제를 추가합니다. 막 resuspension 버퍼의 또 다른 50 ML하려면 1 테아제 억제제의 정제를 추가합니다. 얼음 세 솔루션을 유지.
- 문화에게 세포를 수확하는 대규모 원심 분리기에서 30 분 5,000 RPM을 원심 분리기.
- 100 ML 세포 resuspension 버퍼 (라이 소 자임 50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 2 MM MgCl 2, 1 완료 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제의 정제, 0.1 MG / ML DNAse I, 핀치)에 세포를 Resuspend
- 12,000 PSI (762 게이지 압력)에 프랑스의 압력 셀을 통해 두 번 세포 솔루션을 전달합니다. 병에서 세포 lysate를 수집 얼음이 차가운 유지.
- SS34 원심 분리기 튜브에 세포 lysate를 전송하고 4 10,000 RPM에서 30 분 세포 파편을 제거하기 위해 원심 분리기 ° C를 SS - 34 로터 인치
- 조심스럽게 Ti647.5 초원 심 분리기 튜브에 뜨는를 제거합니다. 4C에서 40,000 rpm으로 50 분 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.
- 약에서 세포 세포막이 들어있는 펠렛을 Resuspend. 막 resuspension 버퍼의 25 ML (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 1 완료 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제의 정제).
- 4시 50 분 Ti647.5 로터에서 40,000 rpm으로 깨끗한 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 막 현탁액을 전송 ° C.
- 뜨는을 취소하고 25 ML 막 resuspension 버퍼에 씻어 멤브레인 펠릿 (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 1 완료 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 테아제 억제제 정제) resuspend.
5. TM 단백질 Solublization :
- resuspended 점막 (25 ML에 대한)에 6 ML 10 % DDM (최종 세제 농도 = 2 %의 DDM) 록 4 혼합물 ° C 2 시간.을 추가
- 4 40 분 40,000 RPM의 혼합물을 원심 ° C 불용성 단백질의 수용성 단백질 세제 단지를 분리 Ti647.5 로터 인치 MexB 단백질 세제 단지를 포함 뜨는을 저장합니다.
6. 아이맥 :
- resuspension 버퍼에 equilibrated 탈론 금속 친화 비즈와 고속 회전에서 얻은 뜨는을 섞는다. 4 롤러에 1 시간을위한 품어 ° C.
- 중력 흐름 열 본문에 슬러리를 붓고과를 통해 흐름을 폐기.
- 아이맥 바인딩 및 씻으 버퍼 20 ML (10 열 볼륨) (50 MM 낮잠, 산도 7, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 0.2 % DDM)와 컬럼을 씻어
- 아이맥 용출 버퍼 (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 250 MM 이미다졸, 0.2 % DDM)와 단백질 Elute.
- 용출 분수 15 μL 샘플을 가지고, polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 분석 15 μL 2X SDS 샘플 버퍼로 각각 섞는다. microcentrifuge에 30sec를 스핀. 각 분획의 MexB의 금액과 순결을 추정하기 위해 10 % polyacrylamide SDS 겔에서 샘플을 분석할 수 있습니다.
- MexB 단백질 세제 단지와 4 회전 농축기에서 그들을 집중을 포함하고있는 분수 수영장 ° C.는 단백질이의 시에 침전하지 않는주의tep.
7. 겔 여과 칼럼 :
- 24 ML 실행 버퍼 (50 MM 낮잠, 산도 7.0, 300 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 0.2 % 베타 octylglucoside)와 Superose 12 HL 10분의 30 컬럼을 사전 평형 및 평면 기준 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
- 실행 버퍼 악타 시스템 로딩 루프 린스.
- 그 결과 해당 컬럼에 그것을 적용하기 전에 주사기 필터를 사용하여 단백질 솔루션을 필터링합니다.
- 5mg / ML 최대의 단백질 농도와 열의에 단백질 용액 240 μL까지로드합니다.
- 버퍼의 1.5 열 볼륨 (36 ML)를 실행, 0.25 ML 분수를 수집합니다. 용출 량의 15 ML - MexB 단백질 세제 단지는 10 시경 최고로 elute해야합니다.
- 정상 분수 5 μL 샘플을 가져가라. 2X SDS 샘플 버퍼 각 샘플 1시 1분를 섞습니다. 각 분획의 MexB의 금액과 순결을 추정하는 10 % polyacrylamide 젤의 샘플을 분석
- 순수 MexB를 포함하는 분수 수영장.
8. 대표 결과 :
그림 1은 겔 여과 칼럼에서 아이맥 열 및 개별 분수에서 풀링된 열 분수와 polyacrylamide 젤이 포함되어 있습니다. 겔 여과 칼럼 후 단백질 쿠매시 스테인드 polyacrylamide 젤로 순수한 나타납니다. 그림 2는 칼럼에서 단백질 세제 콤플렉스 eluting의 주봉을 보여주는 겔 여과 칼럼에서 추적을 포함하고 있습니다. MexB 단백질의 평균 수확량은 2XYT 문화의 6리터 당 약 2 MG입니다.
그림 1. SDS - PAGE MexB의 PDCs의 정화의 젤. 레인 1, 분자량 마커. 2, 아이맥 분수를 풀링. 3-7, 젤 여과 칼럼 분수.
그림 2. MexB 단백질 세제 단지 (PDC)에 대해 젤 여과 결과의 예.
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Discussion
이온 전달, 세포 - 세포 통신, 소포 수송, 세포 구조의 유지 보수 및 호스트 병원체 상호 작용을 포함한 저항, 많은 중요한 세포 활동을 multidrug뿐만 아니라, 세포막에 포함된 단백질을 포함하고 있습니다. Transmembrane 단백질 알려진 단백질의 30 % 이상 만들어 사용 오늘날 의약품의 대다수에 대한 대상입니다. transmembrane 단백질의 접힘이나 부적 절한 활동은 낭성 섬유증과 당뇨병을 포함하여 중요한 유전 질환,로 이어집니다. transmembrane 단백질의 광대한 중요성에도 불구하고, 수용성 단백질에 비해 자신의 구조와 분자 구조에 대해 훨씬 덜 알려져있다. 소수성 시퀀스의 존재는 그것이 어려운 이러한 단백질의 다량을 표현하고 분리하고 많은 생화학 및 구조 방법들이 내화물하게하실 수 있습니다.
이 프로토콜은 가용성 단백질 세제 복합으로 MDR 막 단백질의 표현, 세제 solubilization과 정화를 보여주었다. 이러한 방법은 많은 recombinantly 표현 transmembrane 단백질에 대한 일부 수정과 함께 사용할 수 있습니다. 그 결과 정화 단백질 세제 단지는 용해하고 X - 선 crystallographic 구조 결정 및 liposomes 또는 crosslinking 연구에 reconstitution 등 다른 biophysical 또는 생화학 특성에 대한 결정화 실험에 사용할 수 있습니다.
정화 절차 동안, 단백질 세제 단지는 스핀 농도 단계를하는 동안 밖으로 침전하지 않도록주의하는 것이 중요합니다. 다른 방법은 또한 매우 작은 열 작은 용출 량과 아이맥 단계를 반복으로 겔 여과 단계, 이전 또는 이후에 PDC를 집중하는 데 도움이 될 수도 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 및 Biomolecular 과학 협회에서 CJJ 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
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