Summary
Neste protocolo que demonstram a expressão, solubilização e purificação de uma proteína de membrana recombinantemente expressas, MexB, como um complexo proteína solúvel detergente. MexB é um transportador de membrana multirresistência do oportunista Pseudomonas aeruginosa bacteriana patogênica.
Abstract
Multirresistência (MDR), a capacidade de uma célula cancerosa ou patógeno para ser resistente a uma ampla variedade de estrutural e funcionalmente não relacionados drogas anti-câncer ou antibióticos, é um problema atual graves na saúde pública. Esta resistência a múltiplas drogas é em grande parte devido à energia dependente de bombas de efluxo de drogas. As bombas de expulsar drogas anti-câncer ou antibióticos para o meio externo, reduzindo sua concentração intracelular abaixo de um limiar tóxico. Estamos estudando a resistência a múltiplas drogas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista que causa infecções bacterianas em pacientes com diversos tipos de lesões ou doença, por exemplo, queimaduras ou fibrose cística, e também em imuno-comprometidos diálise, câncer e pacientes transplantados. As bombas de efluxo MDR grandes em P. aeruginosa são complexos tripartite composta por uma membrana interna antiporter prótons drogas (RND), um canal de membrana externa (OMF), e uma proteína linker periplasmic (MFP) 1-8. As proteínas RND e OMF são proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de todas as proteínas e são 65% dos alvos de drogas atual. Os domínios transmembrana hidrofóbica fazer as proteínas insolúveis em tampão aquoso. Antes de uma proteína transmembrana pode ser purificado, é necessário encontrar condições tampão contendo um detergente suave que permitem que a proteína seja solubilizada como um complexo de proteína de detergente (PDC) 11/09. Neste exemplo, usamos uma proteína RND, o P. aeruginosa transportador transmembrana MexB, para demonstrar a forma de expressar uma forma recombinante da proteína transmembrana, solubilizar-lo usando os detergentes, em seguida, purificar o detergente complexos de proteína. Este método geral pode ser aplicado à expressão, purificação e solubilização de muitas outras proteínas da membrana recombinantemente expressas. Os complexos de proteína detergente pode ser usado posteriormente para a caracterização bioquímica ou biofísica, incluindo raios-X a determinação da estrutura de cristal ou estudos de reticulação.
Protocol
1. Dia 1:
MexB de Pseudomonas aeruginosa é codificado por pFB101. O gene foi amplificado MexB de P. DNA genômico aeruginosa e inserida no NdeI e sítios de restrição XhoI do + pET30b vetor. A construção contém uma tag hexahistidine C-terminal.
- O plasmídeo é usado para transformar E. coli cepa C43 (DE3) 12, e os transformantes são semeadas em ágar LB contendo canamicina 30 ug / mL.
2. Dia 2: Culturas Pernoite:
- À noite, 4 X 3 culturas LB contendo 30 mL de canamicina ug / mL são inoculados das colônias transformantes fresco. Alternativamente, as culturas podem ser inoculados a partir de uma perm congelados.
Estas pequenas culturas são cultivadas em um rolo a 37 ° C durante a noite.
3. Dia 3: Growing 6 Culturas Liter:
- Na parte da manhã, use as culturas durante a noite para inocular 150 mL contendo 30 LB canamicina ug / mL. Crescer a cultura a 37 ° C em um shaker.
- Na parte da tarde, use a cultura pequeno para vacinar 6 x 1L 2XYT mídia contendo 30 ug / mL de canamicina em frascos Fernbach. (Use 25 ml por cultura para uma diluição de 1:40). Crescer as culturas a 37 ° C até atingirem uma DO 600 de 0,4-0,6, cerca de 1,5 horas
- Quando as culturas chegar a densidade adequada, induzir a expressão da proteína pela adição de 0,5 mL IPTG 1M. Coloque todos os frascos de volta no shaker e continuar a cultivá-las a 30 ° C durante a noite.
4. Dia 4: A colheita de células e purificação da proteína:
- Adicionar inibidores da protease, DNAse, e lisozima às soluções de buffer da seguinte forma: a 50 mL de tampão de ressuspensão de células, adicionar 10 mg DNaseI (0,1 concentração mg / mL final), 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, e uma pitada de lisozima . A 60 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Para outro de 50 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Manter todas as três soluções no gelo.
- Centrifugar as culturas 30 min 5000 rpm em grande escala de centrífuga para a colheita das células.
- Ressuspender as células em 100 mL de buffer ressuspensão de células (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, 0,1 mg / mL DNAse I, pitada de lisozima)
- Passe a solução da célula duas vezes através de uma célula de pressão francesa em 12.000 psi (762 pressão manométrica). Recolher o lisado celular em um frasco mantido frio no gelo.
- Transferir o lisado celular para SS34 tubos de centrífuga e centrifugar para remover detritos celulares por 30 min a 10.000 rpm a 4 ° C em um rotor SS-34.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga Ti647.5. Centrifugação de 50 min a 40.000 rpm a 4C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento, que contém as membranas celulares, em aprox. 25 mL de tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease).
- Transferir a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrifugar a 40.000 rpm em um rotor Ti647.5 por 50 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet lavado membrana em 25 mL tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease).
5. TM Solublization Protein:
- Para as membranas ressuspenso (cerca de 25 mL), adicionar 6 mL DDM 10% (concentração final = DDM detergente 2%) Rock a mistura a 4 ° C por 2 horas.
- Centrifugar a mistura a 40.000 rpm por 40 min a 4 ° C no rotor Ti647.5 para separar os complexos detergente proteína solúvel das proteínas insolúveis. Salve o sobrenadante, que contém os complexos detergente MexB proteína.
6. IMAC:
- Misture o sobrenadante obtido a partir da rotação de alta velocidade com os grânulos de metal talon afinidade equilibrada em tampão de ressuspensão. Incubar por 1 hora em um rolo a 4 ° C.
- Despeje a pasta em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descartar a fluir.
- Lavar a coluna com 20 mL (10 volumes de coluna) de tampão de Encadernação e Wash IMAC (50 Nap mM, pH 7, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% DDM)
- Eluir a proteína com tampão de eluição IMAC (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 250 mM imidazol, 0,2% DDM).
- Tome 15 amostras mL das frações de eluição, misture com 15 tampão de amostra 2X SDS mL para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida. Spin-30seg em microcentrífuga. Analisar as amostras em um 10% de poliacrilamida SDS gel para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração.
- Piscina das frações contendo os complexos de proteína MexB detergente e concentrá-las em um concentrador de giro a 4 ° C. Tenha cuidado para que a proteína não precipitar nesta step.
7. Coluna de filtração em gel:
- Pré-equilibrar um Superose 12 HL 30/10 coluna com 24 mL de tampão execução (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% de beta-octylglucoside), e esperar por uma base plana.
- Lavar a Akta circuito de carga do sistema com tampão de corrida.
- Filtrar a solução de proteína usando um filtro de seringa antes de aplicá-la à coluna.
- Carga de até 240 mL da solução de proteína para a coluna, com uma concentração de proteína de até 5 mg / mL.
- Executar 1,5 volumes de coluna (36 mL) de tampão, coletar frações 0,25 mL. O detergente MexB complexos de proteína deve eluir como um pico em torno de 10-15 mL de volume de eluição.
- Take 5 mL de amostras das frações de pico. Mix cada amostra 1:1 com tampão de amostra 2X SDS. Analisar as amostras em gel de poliacrilamida 10% para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração
- Piscina as frações contendo MexB puro.
8. Resultados representativos:
Figura 1 inclui um gel de poliacrilamida com frações obtidos a partir de coluna a coluna IMAC e frações individuais da coluna de filtração em gel. Depois que a coluna de filtração em gel a proteína aparece pura por Coomassie gel de poliacrilamida corado. Figura 2 inclui um rastreio a partir da coluna de filtração em gel mostrando o pico principal do complexo de proteínas detergente eluição da coluna. O rendimento médio de proteína MexB é de aproximadamente 2 mg por 6 litros de cultura 2XYT.
Figura 1. SDS-PAGE em gel de purificação dos PDCs MexB. Lane 1, marcadores de peso molecular. 2, Pooled frações IMAC. 07/03, coluna Gel frações de filtração.
Figura 2. Exemplo de Resultados Gel Filtração para complexos de proteína MexB detergente (PDC).
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Discussion
Além de multirresistência, muitas atividades vitais celulares, incluindo ion transporte, comunicação célula-célula, transporte de vesículas, a manutenção da estrutura celular e Interações Hospedeiro-Patógeno, envolvem proteínas que são incorporados na membrana da célula. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de proteínas conhecidas e são as metas para a maioria dos fármacos em uso hoje. O dobramento imprópria ou atividade das proteínas transmembrana levar a importantes doenças genéticas, incluindo a fibrose cística e diabetes. Apesar da grande importância de proteínas transmembrana, há muito menos sabe sobre as suas estruturas e mecanismos moleculares de proteínas solúveis. A presença de seqüências hidrofóbicas pode tornar difícil de expressar e isolar grandes quantidades dessas proteínas e os torna refratários a muitos métodos bioquímicos e estruturais.
Este protocolo demonstra a expressão solubilização detergente, e purificação de uma proteína de membrana MDR como um complexo proteína solúvel detergente. Estes métodos podem ser usados com algumas modificações para muitas proteínas transmembrana recombinantemente expressas. O resultado complexos detergente proteína purificada são solúveis e podem ser usados para ensaios de cristalização de raios-X a determinação da estrutura cristalográfica e para a caracterização biofísica ou bioquímica, incluindo a reconstituição em lipossomos ou estudos de reticulação.
Durante os procedimentos de purificação, é importante ter cuidado que os complexos de proteína detergente não precipitar durante as etapas de concentração de spin. Diferentes métodos podem também ser usados para ajudar a concentrar o PDC antes ou após a etapa de filtração em gel, como repetindo o passo IMAC com uma coluna muito pequeno e pequeno volume de eluição.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este projeto foi suportado por concessões para CJJ da National Science Foundation e pela Sociedade de Ciências Biomolecular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
