A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

Source : Jia, Z. et al., A 5-mC Dot Blot Assay Quantification du niveau de méthylation de l’ADN de la dédifférenciation des chondrocytes in vitro.J. Vis. Exp.(2017)

Cette vidéo décrit la technique du dot-blot pour déterminer le niveau de méthylation de l’ADN dans les chondrocytes humains in vitro via le transfert d’échantillons d’ADN sur une membrane en nylon et la visualisation ultérieure à l’aide d’anticorps monoclonaux. Cela permet de déterminer le phénotype des chondrocytes à différents stades de la culture.

Protocol

1. Collection de tissus de cartilage articulaire humain et culture de chondrocytes

1. Préparation des matériaux
   1. Préparez le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine. Préparez 1 mg/mL de collagénase II, 0,25 % de trypsine-EDTA, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une passoire cellulaire (nylon 40 μm).
2. Prélèvement de tissu cartilagineux articulaire humain
   1. Isolez le cartilage articulaire des articulations du genou des patients donneurs après un traumatisme. Obtenir le consentement éclairé de tous les participants.
   2. Coupez le cartilage en³ morceaux de 1 à 2 mm à l’aide d’un scalpel stérile et digérez les chondrocytes du cartilage haché avec 1 mg/mL de collagénase II dans du DMEM à 37 °C pendant 12 à 16 h.
   3. Filtrez la suspension cellulaire résultante à travers une crépine cellulaire (40 μm) et lavez-la deux fois avec du PBS.
   4. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et semer à une densité de 20 000 à 30 000 cellules/^cm2 dans du DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
   5. Culture en incubateur à 37 °C.
3. Expansion des chondrocytes monocouches
   1. Récoltez les cellules subconfluentes en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA et replaquez-les à une densité de 6 600 cellules/^cm2. Changez de support deux fois par semaine.
   2. Cultivez des chondrocytes en monocouches sur un maximum de six passages et évaluez-les aux passages 1, 2, 3, 4 et 5.

2. Extraction de l’ADN génomique (ADNg)

1. Prélever les cellules et les remettre en suspension dans un tampon de lyse de 500 μL (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5 % SDS, 200 μg/mL de RNase A) par 10 millions de cellules. Remettre les cellules en suspension par pipetage et inversion rapide, puis incuber pendant 1 h à 37 °C.
2. Ajouter la protéinase K à une concentration de 160 μg/mL de lysat cellulaire et inverser vigoureusement le mélange. Incuber 6 h à 55 °C.
3. Ajouter à l’échantillon un volume d’alcool phénol :chloroforme :isoamylique saturé Tris pH 7,9 (25:24:1). Agitez soigneusement l’échantillon à la main pendant environ 20 s.
4. Centrifuger l’échantillon à température ambiante pendant 5 min à 13 000 × g. Retirez la phase aqueuse supérieure et transférez la couche dans un tube frais.
5. Extrayez avec un volume égal de chloroforme pour éliminer le phénol et transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube frais.
6. Précipitez l’ADN en ajoutant 0,1 volume d’échantillon de 3 M d’acétate de sodium pH 8,0 et 2 volumes d’éthanol à 100 %.
7. Conservez le tube à -20 °C pendant la nuit pour précipiter l’ADNg.
8. Centrifuger l’échantillon à 4 °C pendant 10 min à 16 000 x g pour obtenir de la pastille d’ADNg.
9. Laver l’échantillon trois fois avec de l’éthanol à 70 % et le centrifuger à 4 °C pendant 2 minutes à 13 000 x g.
10. Retirez le surnageant avec précaution, puis séchez-le à l’air libre. Remettre l’ADN en suspension dans 10 mM de Tris pH 8,0, 0,1 mM d’EDTA.

3. Profilage de méthylation de l’ADN

1. Utilisez un kit de méthylation de l’ADN pour effectuer la réaction de conversion du bisulfite en utilisant un total de 500 ng d’ADN génomique, selon le protocole du fabricant. Éluer dans 10 μL de tampon d’élution (50 ng/μL).
2. Effectuer le profilage de méthylation de l’ADN à l’aide d’un kit commercial selon le protocole du fabricant.

4. Analyse par transfert de points

1. Dénaturer l’ADN isolé (1 mg par échantillon) dans 0,1 M de NaOH pendant 10 min à 95 °C. Neutraliser l’ADN avec 1 M NH₄OAc sur glace, puis diluer deux fois. Spot 2 μL de l’ADN génomique dilué en série sur une membrane N⁺.
2. Éponger la membrane à 80 °C pendant 30 min.
3. Bloquez les sites de liaison des anticorps non spécifiques en trempant la membrane N⁺ dans 5 % de BSA dans du TBS-T pendant 1 h. Utilisez une boîte de Pétri de 10 cm comme chambre de réaction à température ambiante.
4. Après un lavage de 5 minutes trois fois dans du TBST, incuber la membrane avec un anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine (5-mC) de souris (1:1 000) dans du TBS-T à 4 °C pendant la nuit.
5. Laver la membrane pendant 5 minutes trois fois dans du TBS-T, puis incuber avec un anticorps secondaire, l’immunoglobuline G (IgG) de souris (1:5 000) de mouton conjuguée à la HRP pendant 1 h à température ambiante.
6. Laver la membrane pendant 5 min trois fois dans du TBS-T.
7. Ajoutez le substrat enzymatique à la membrane et incubez pendant 5 à 10 min. Visualisez le signal de l’anticorps secondaire à l’aide d’un kit de chimiluminescence selon les instructions du fabricant.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE