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Abstract

Fuente: Jia, Z. et al., Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC que cuantifica el nivel de metilación del ADN de la desdiferenciación de condrocitos in vitro.J. Vis. Exp.(2017)

Este video describe la técnica de dot-blot para determinar el nivel de metilación del ADN en condrocitos humanos in vitro a través de la transferencia de muestras de ADN en una membrana de nylon y la posterior visualización utilizando anticuerpos monoclonales. Esto ayuda a determinar el fenotipo de los condrocitos en varias etapas del cultivo.

Protocol

1. Recolección de tejido de cartílago articular humano y cultivo de condrocitos

1. Preparación de materiales
   1. Prepare el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina. Prepare 1 mg/mL de colagenasa II, tripsina-EDTA al 0,25%, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y un colador de células (40 μm de nylon).
2. Recolección de tejido de cartílago articular humano
   1. Aísle el cartílago articular de las articulaciones de la rodilla de los pacientes donantes después de un traumatismo. Obtener el consentimiento informado de todos los participantes.
   2. Cortar el cartílago en trozos de 1-2 mm³ con un bisturí estéril y digerir los condrocitos del cartílago picado con 1 mg/ml de colagenasa II en DMEM a 37 °C durante 12-16 h.
   3. Filtrar la suspensión celular resultante a través de un colador celular (40 μm) y lavar dos veces con PBS.
   4. Cuente las células con un hemocitómetro y la semilla a una densidad de 20.000-30.000 células/^cm2 en DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina.
   5. Cultivo en incubadora a 37 °C.
3. Expansión de condrocitos monocapa
   1. Recoja las células subconfluentes utilizando tripsina-EDTA al 0,25% y vuelva a colocar la placa a una densidad de 6.600 células/^cm2. Cambie el medio dos veces por semana.
   2. Cultive condrocitos en monocapas durante un máximo de seis pasos y evalúe en los pasajes 1, 2, 3, 4 y 5.

2. Extracción de ADN genómico (ADNg)

1. Recoja las células y vuelva a suspenderlas en un tampón de lisis de 500 μL (15 mM de Tris pH 8,0, 10 mM de EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg/mL de ARNasa A) por cada 10 millones de células. Resuspender las células mediante pipeteo e inversión rápida, e incubar durante 1 h a 37 °C.
2. Añadir proteinasa K a una concentración de 160 μg/mL de lisado celular e invertir la mezcla vigorosamente. Incubar 6 h a 55 °C.
3. Añadir un volumen de alcohol saturado de fenol:cloroformo-isoamílico Tris pH 7,9 (25:24:1) a la muestra. Agite la muestra a mano durante aproximadamente 20 s.
4. Centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min a 13.000 × g. Retire la fase acuosa superior y transfiera la capa a un tubo nuevo.
5. Extraiga con un volumen igual de cloroformo para eliminar el fenol y transferir la fase acuosa superior a un tubo fresco.
6. Precipite el ADN añadiendo 0,1 volumen de muestra de acetato de sodio 3 M pH 8,0 y 2 volúmenes de etanol al 100%.
7. Almacene el tubo a -20 °C durante la noche para precipitar el ADNg.
8. Centrifugar la muestra a 4 °C durante 10 min a 16.000 x g para granular el ADNg.
9. Lavar la muestra tres veces con etanol al 70% y centrifugar a 4 °C durante 2 min a 13.000 x g.
10. Retire el sobrenadante con cuidado y luego séquelo al aire. Resuspender el ADN en 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA.

3. Perfil de metilación del ADN

1. Utilice un kit de metilación del ADN para realizar la reacción de conversión de bisulfito utilizando un total de 500 ng del ADN genómico, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluido en 10 μL de tampón de elución (50 ng/μL).
2. Realice el perfil de metilación del ADN utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.

4. Análisis de Dot Blot

1. Desnaturalizar el ADN aislado (1 mg por muestra) en NaOH 0,1 M durante 10 min a 95 °C. Neutralizar el ADN con 1 M de NH₄OAc en hielo y luego diluir dos veces. Detecte 2 μL del ADN genómico diluido en serie en una membrana N⁺.
2. Seque la membrana a 80 °C durante 30 min.
3. Bloquee los sitios de unión de anticuerpos no específicos sumergiendo la membrana N⁺ en BSA al 5% en TBS-T durante 1 h. Utilice una placa de Petri de 10 cm como cámara de reacción a temperatura ambiente.
4. Después de lavar 5 min tres veces en TBST, incubar la membrana con un anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina (5-mC) de ratón (1:1.000) en TBS-T a 4 °C durante la noche.
5. Lavar la membrana durante 5 min tres veces en TBS-T, y luego incubar con un anticuerpo secundario, inmunoglobulina-G (IgG) de oveja conjugada con HRP (1:5.000) en TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Lave la membrana durante 5 minutos tres veces en TBS-T.
7. Agregue el sustrato enzimático a la membrana e incube durante 5-10 min. Visualice la señal de anticuerpo secundario utilizando un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE