A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

المصدر: Hillert-Richter ، L. K. et al. ، قياس تكوين مركب الإشارات المحفز للموت CD95 ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع. J. Vis. Exp. (2021).

يصف هذا الفيديو النشاف الغربي القائم على التلألؤ الكيميائي للمحللات المناعية المرسبة. تساعد هذه التقنية في تحديد معالجة البروتين وتنشيطه. تتناسب الإشارة الكيميائية المكتشفة مع مستوى معالجة البروتين أثناء تنشيطه.

Protocol

تم إجراء تجارب الخلايا التائية

وفقا للاتفاقية الأخلاقية 42502-2-1273 Uni MD.

1. تحضير الخلايا للتجربة

ملاحظة: متوسط عدد الخلايا لهذا الترسيب المناعي هو 1 × 10⁷. يجب زرع الخلايا الملتصقة قبل يوم واحد من التجربة بحيث يكون هناك 1 × 10 7 خلايا في يوم التجربة.

1. تحضير الخلايا الملتصقة للتجربة
   1. البذور 5-8 × 10⁶ خلايا ملتصقة في 20 مل من الوسط (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) لكل حالة في أطباق 14.5 سم قبل يوم واحد من بدء التجربة.
   2. في يوم التجربة ، تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 80-90٪ وتلتزم بالطبق. تخلص من الوسيط وأضف وسيطا جديدا إلى الخلايا الملتصقة.
2. تحضير خلايا التعليق للتجربة
   1. ضع بعناية 1 × 10⁷ خلايا معلقة في 10 مل من وسط الثقافة (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) لكل حالة في أطباق مقاس 14.5 سم مباشرة قبل بدء التجربة.
   2. في حالة استخدام الخلايا الأولية ، قم بعزل الخلايا التائية الأولية وفقا للإجراء الموضح سابقا. عالج الخلايا التائية الأولية ب 1 ميكروغرام / مل من الهيماجلوتينين النباتي لمدة 24 ساعة ، متبوعا ب 25 وحدة / مل علاج IL2 لمدة 6 أيام.
   3. ضع بعناية 1 × 10⁸ خلايا تائية أولية في 10 مل من وسط الاستزراع (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) لكل حالة في أطباق مقاس 14.5 سم مباشرة قبل بدء التجربة.
      ملاحظه: يوصى بهذا العدد الأكبر من الخلايا التائية الأولية ، لأن هذه الخلايا أصغر.

فئة

2. تحفيز CD95L

1. تحفيز الخلايا باستخدام CD95L (تم إنتاجه كما هو موضح سابقا أو متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
   ملاحظه: يعتمد تركيز CD95L ووقت التحفيز على نوع الخلية. قم بإعداد حالة تحفيز واحدة مرتين لإنشاء عينة “تحكم في الخرزة” بالتوازي.
   1. تحفيز الخلايا الملتصقة بالتركيز المحدد من CD95L. أمسك اللوحة بزاوية وقم بإدخال الترابط في الوسط دون لمس الخلايا الملتصقة.
   2. تحفيز خلايا التعليق باستخدام CD95L عن طريق سحب محلول الترابط في معلق الخلية.

3. حصاد الخلايا وتحللها

1. ضع أطباق الخلية على الثلج.
   ملاحظه: لا تتخلص من الوسيط. تطفو الخلايا المحتضرة في الوسط وهي مهمة للتحليل.
2. أضف 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات البارد (PBS) إلى تعليق الخلية واكشط الخلايا المرفقة من اللوحة. اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 50 مل.
3. اغسل طبق الخلية ب 10 مل من PBS البارد مرتين وضع محلول الغسيل في نفس الأنبوب سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية.
4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من PBS البارد. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من PBS البارد.
6. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من محلول التحلل (يحتوي على كوكتيل مثبط للبروتينات بنسبة 4٪). احتضنها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
7. جهاز الطرد المركزي للمحللة بسرعة قصوى (~ 17,000 × جم) لمدة 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية.
8. انقل المادة الطافية (المحللة) إلى أنبوب نظيف. تخلص من الحبيبات. خذ 50 ميكرولتر من المحللة في أنبوب آخر. قم بتحليل تركيز البروتين عن طريق فحص برادفورد وخذ كمية المحللة المقابلة ل 25 ميكروغرام من البروتين في قارورة. أضف مخزن التحميل (انظر جدول المواد للتكوين) إلى القارورة. قم بتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية كعنصر تحكم في المحلل.

4. الترسيب المناعي (IP)

1. أضف 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة ل APO-1 و 10 ميكرولتر من حبات سيفاروز البروتين A (المحضرة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) إلى المحللة. أضف 10 ميكرولتر فقط من الخرزات إلى أنبوب منفصل يحتوي على محللة (عينة محفزة) لإنشاء “تحكم في الخرزة><". ملاحظه: استخدم أطراف الماصة ذات الفتحات العريضة إما عن طريق قص الأطراف أو شراء نصائح خاصة للملكية الفكرية أثناء التعامل مع حبات البروتين A sepharose.
2. احتضان خليط المحللة مع الأجسام المضادة / حبات السيفاروز البروتين A مع الخلط اللطيف بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. الطرد المركزي المحللات بالأجسام المضادة / حبات البروتين A سيفاروز عند 500 × جم لمدة 4 دقائق ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 1 مل من PBS البارد إلى الخرز ، وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل.
3. تخلص من المادة الطافية. يفضل أن يكون استنشاق الخرزات باستخدام حقنة هاميلتون سعة 50 ميكرولتر.

5. وصمة عار غربية

1. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التحميل 4x (انظر جدول المواد لمعرفة التركيبة) إلى الخرز وقم بتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. قم بتحميل المحللات و IP ومعيار البروتين على هلام 12.5٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) (انظر جدول المواد لتحضير الجل) وقم بتشغيله بجهد ثابت يبلغ 80 فولت.
3. انقل البروتينات من هلام SDS إلى غشاء النيتروسليلوز.
   ملاحظه: هنا ، تم استخدام التقنية شبه الجافة ، المحسنة للبروتينات ذات الأهمية ، للنقل على مدى 12 دقيقة (25 فولت ؛ 2.5 أمبير = ثابت). انقع غشاء النيتروسليلوز واثنين من مكدسات النقل صغيرة الحجم في المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي (انظر جدول المواد للتكوين ، وقم بالتحضير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) لبضع دقائق قبل النشاف الغربي.
4. ضع الغشاء النشاف في صندوق وقم بحجبه لمدة ساعة واحدة في محلول مانع (0.1٪ Tween-20 في PBS (PBST) + 5٪ حليب). احتضان الغشاء بمحلول الحجب تحت التحريض اللطيف.
5. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.

6. كشف اللطخة الغربية

1. أضف أول جسم مضاد أولي عند التخفيف المشار إليه (انظر جدول المواد) إلى الغشاء واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف.
2. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
3. احتضان الغشاء ب 20 مل من الجسم المضاد الثانوي (مخفف 1: 10,000 في PBST + 5٪ حليب) مع رج لطيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
4. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
5. تخلص من PBST وأضف ما يقرب من 1 مل من ركيزة بيروكسيداز الفجل إلى الغشاء.
6. اكتشف إشارة التلميء الكيميائي (انظر جدول المواد).
   ملاحظه: يعتمد وقت التعرض وعدد الصور الملتقطة على كمية البروتين في الخلية وخصوصية الأجسام المضادة المستخدمة. يجب أن يتم تحديده تجريبيا لكل جسم مضاد يستخدم للكشف.

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000