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Abstract

Source : Hillert-Richter, L. K. et al., Mesure de la composition du complexe de signalisation induisant la mort CD95 et traitement de la procaspase-8 dans ce complexe. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit le transfert western basé sur la chimiluminescence des lysats immunoprécipités. La technique aide à déterminer le traitement et l’activation des protéines. Le signal chimiluminescent détecté est proportionnel au niveau de traitement des protéines lors de son activation.

Protocol

Les expériences sur les cellules T ont été réalisées conformément à l’accord éthique 42502-2-1273 Uni MD.

1. Préparation des cellules pour l’expérience

REMARQUE : Le nombre moyen de cellules pour cette immunoprécipitation est de 1 × 10⁷. Les cellules adhérentes doivent être ensemencées un jour avant l’expérience de sorte qu’il y ait 1 × 10⁷ cellules le jour de l’expérience.

1. Préparation des cellules adhérentes pour l’expérience
   1. Semez 5 à 8 × 10 6 cellules adhérentes dans 20 mL de milieu (voir le tableau des matériaux pour la composition) pour chaque condition dans des boîtes de 14,5 cm un jour avant le début de l’expérience.
   2. Le jour de l’expérience, assurez-vous que les cellules sont confluentes à 80-90 % et adhèrent à la parabole. Jetez le milieu et ajoutez du milieu frais aux cellules adhérentes.
2. Préparation des cellules en suspension pour l’expérience
   1. Placez soigneusement 1 × 10⁷ cellules de suspension dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des boîtes de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
   2. Si vous utilisez des cellules primaires, isolez les cellules T primaires conformément à la procédure décrite précédemment. Traiter les lymphocytes T primaires avec 1 μg/mL de phytohémagglutinine pendant 24 h, suivi d’un traitement à 25 U/mL d’IL2 pendant 6 jours.
   3. Placez soigneusement 1 × 10⁸ lymphocytes T primaires dans 10 ml de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des boîtes de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
      note: Ce nombre plus élevé de lymphocytes T primaires est recommandé, car ces cellules sont plus petites.

2. Stimulation du CD95L

1. Stimulez les cellules avec le CD95L (produit comme décrit précédemment ou disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
   note: La concentration du CD95L et le temps de stimulation dépendent du type cellulaire. Préparez deux fois une condition de stimulation pour générer un échantillon de « contrôle de billes » en parallèle.
   1. Stimulez les cellules adhérentes avec la concentration sélectionnée de CD95L. Tenez la plaque en biais et piquez le ligand dans le milieu sans toucher les cellules adhérentes.
   2. Stimulez les cellules en suspension avec le CD95L en pipetant la solution de ligand dans la suspension cellulaire.

3. Récolte cellulaire et lyse

1. Placez les paraboles cellulaires sur de la glace.
   note: Ne jetez pas le support. Les cellules mourantes flottent dans le milieu et sont importantes pour l’analyse.
2. Ajoutez 10 ml de solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) dans la suspension cellulaire et grattez les cellules attachées de la plaque. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml.
3. Lavez deux fois la parabole avec 10 ml de PBS froid et placez la solution de lavage dans le même tube de 50 ml. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 5 min, 4 °C.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lyse (contenant 4 % de cocktail inhibiteur de protéase). Incuber 30 min sur de la glace.
7. Centrifuger le lysat à vitesse maximale (~17 000 × g) pendant 15 min, 4 °C.
8. Transférez le surnageant (lysat) dans un tube propre. Jetez la pastille. Prenez 50 μL de lysat dans un autre tube. Analyser la concentration en protéines par le test de Bradford et prélever la quantité de lysat correspondant à 25 μg de protéines dans un flacon. Ajoutez un tampon de chargement (voir la table des matériaux pour la composition) au flacon. Conservez-le à -20 °C comme contrôle du lysat.

4. Immunoprécipitation (IP)

1. Ajouter au lysat 2 μL d’anticorps anti-APO-1 et 10 μL de billes de sépharose de protéine A (préparées selon les recommandations du fabricant). Ajoutez seulement 10 μL des billes dans un tube séparé contenant du lysat (échantillon stimulé) pour générer un « contrôle des billes
   note: Utilisez des pointes de pipette à orifices larges, soit en coupant les pointes, soit en achetant des pointes spéciales pour IP lors de la manipulation des billes de sépharose de protéine A.
2. Incuber le mélange de billes de sépharose avec des anticorps/protéines A en les mélangeant doucement pendant une nuit à 4 °C. Centrifuger les lysats avec des billes de sépharose anticorps/protéine A à 500 × g pendant 4 min, 4 °C. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de PBS froid aux billes et répéter cette étape au moins trois fois.
3. Jetez le surnageant. Aspirez les perles de préférence avec une seringue Hamilton de 50 μL.

5. Transfert de Western

1. Ajouter 20 μL de tampon de chargement 4x (voir le tableau des matériaux pour la composition) dans les billes et chauffer à 95 °C pendant 10 min. Chauffer les témoins de lysat à 95 °C pendant 5 min.
2. Chargez les lysats, les IP et un étalon protéique sur un gel de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 12,5 % (voir le tableau des matériaux pour la préparation du gel) et faites-le fonctionner avec une tension constante de 80 V.
3. Transférez les protéines du gel SDS vers une membrane de nitrocellulose.
   note: Ici, la technique semi-sèche, optimisée pour les protéines d’intérêt, a été utilisée pour le transfert sur 12 min (25 V ; 2,5 A= constante). Faites tremper la membrane de nitrocellulose et deux piles de transfert de taille miniature dans un tampon d’électrophorèse (voir le tableau des matériaux pour la composition, préparer selon les instructions du fabricant) pendant quelques minutes avant le western blot.
4. Placez la membrane tamponnée dans une boîte et bloquez-la pendant 1 h dans une solution bloquante (0,1 % de Tween-20 dans du PBS (PBST) + 5 % de lait). Incuber la membrane avec la solution de blocage sous une légère agitation.
5. Lavez la membrane trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque lavage.

6. Détection par transfert Western

1. Ajouter le premier anticorps primaire à la dilution indiquée (voir tableau des matériaux) dans la membrane et l’incuber pendant la nuit à 4 °C en l’agitant doucement.
2. Lavez la membrane trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque lavage.
3. Incuber la membrane avec 20 mL d’anticorps secondaires (dilué 1:10 000 dans du PBST + 5 % de lait) en agitant doucement pendant 1 h à température ambiante.
4. Lavez la membrane trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque lavage.
5. Jeter le PBST et ajouter environ 1 mL de substrat de peroxydase de raifort à la membrane.
6. Détecter le signal chimiluminescent (voir Tableau des matériaux).
   note: Le temps d’exposition et le nombre d’images capturées dépendent de la quantité de protéines dans la cellule et de la spécificité des anticorps utilisés. Il doit être établi empiriquement pour chaque anticorps utilisé pour la détection.

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000