A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

المصدر: Li, J., et al. تحديد أحداث إعادة التركيب المتماثلة في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل. J. Vis. Exp. (2018).

في هذا الفيديو ، نصف تقنية النشاف الجنوبي لتحديد أحداث إعادة التركيب المتماثلة في جينوم الخلايا الجذعية الجنينية للفأر باستخدام مجسات ذات علامات إشعاعية. تظهر مناطق الحمض النووي التي تحتوي على أحداث إعادة التركيب المتجانسة كنطاقات مميزة عندما يتعرض الغشاء الذي يحتوي على الحمض النووي المرتبط بالمسبار للأشعة السينية.

Protocol

1. تحضير الحمض النووي الجيني والهضم باستخدام إنزيم (إنزيمات) التقييد

1. تحضير gDNA من الخلايا الجذعية الجنينية (الخلايا الجذعية الجنينية ) باستخدام مجموعة تجارية (مجموعة تنقية الحمض النووي الجيني) مع تعديلات طفيفة.
   1. قم بإزالة الوسائط من ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية وأضف 500 ميكرولتر من محلول تحلل النوى ، بما في ذلك RNaseA ، مباشرة إلى الآبار لتحلل الخلايا.
      ملاحظه: يمكن تخزين محللة الخلية عند -80 درجة مئوية أو معالجتها على الفور.
   2. Pipet لأعلى ولأسفل عدة مرات لتحلل الخلايا بالكامل ونقلها إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل.
   3. أضف ثلث حجم محلول ترسيب البروتين إلى أنبوب 1.5 مل ، وقم بدوامة قوية لمدة 20 ثانية ، وقم بتبريد العينات على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي بقوة 2,000 × جم لمدة 5 دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب آخر نظيف سعة 1.5 مل يحتوي على كمية متساوية من الأيزوبروبانول ؛ امزج المحلول برفق. (لاحظ أنه يمكن رؤية خيوط بيضاء تشبه الخيوط في هذه اللحظة.) جهاز طرد مركزي بقوة 2,000 × جم لمدة 1 دقيقة ؛ ثم تخلص من الطافف.
   4. اغسل حبيبات gDNA ب 1 مل من 70٪ إيثانول في درجة حرارة الغرفة ، وجهاز طرد مركزي بقوة 2,000 × جم لمدة 1 دقيقة ، وشفط المادة الطافية بعناية ، ثم جفف حبيبات gDNA بالهواء لمدة 3 دقائق.
   5. قم بإذابة gDNA ب 100 ميكرولتر من محلول معالجة الحمض النووي ، ثم احتضانه عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
   6. قم بتخزين gDNA عند 2-8 درجة مئوية.
2. قم بهضم gDNAs باستخدام RE Dra I. المصمم مسبقا ، قم بإعداد تفاعل هضم 30 ميكرولتر عن طريق خلط 3 ميكرولتر من 10x buffer ل Dra I ، و 3 ميكرولتر من Dra I ، و 10 ميكروغرام من gDNA / عينة ، و H₂O حتى 30 ميكرولتر ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
3. تحقق من اكتمال الهضم بواسطة هلام الحمض النووي ، وتحليل 5 ميكرولتر من التفاعل المهضوم ، ثم أضف 3 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي للخطوة التالية.

2. النشاف الجنوبي

1. فحص النشاف الجنوبي
   1. افصل gDNA المهضوم عن طريق الرحلان الكهربائي وانقلها إلى غشاء.
      1. قم بإعداد هلام الرحلان الكهربائي للأغاروز بنسبة 1٪ مع بروميد الإيثيديوم (EB) ، وقم بتحميل عينات gDNA المهضومة وسلم 1 كيلو بايت ، وقم بتشغيل الجل بجهد منخفض (30-40 فولت) بين عشية وضحاها.
      2. أخرج الجل والتقط صورة باستخدام نظام تصوير هلام الحمض النووي بعد الرحلان الكهربائي. تحقق مما إذا كانت gDNA المهضومة والمنفصلة تعرض صورة تشبه اللطاخة.
      3. انقع الجل في صينية بمحلول 0.2 نيوتن حمض الهيدروكلوريك ورجه برفق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      4. انقل الجل إلى محلول تغيير طبيعة الحمض النووي ورجه برفق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      5. قم بتبديل الجل إلى محلول محايد للحمض النووي ورجه برفق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
         ملاحظه: الجل عرضة للكسر بعد هذه الخطوة ، لذلك يجب التعامل معه بعناية.
      6. استخدم نظام النقل السريع لأسفل لنقل الحمض النووي من الجل إلى الغشاء. قم بتجميع مكدس TurboBlotter والنشاف وفقا للتعليمات المقدمة من الشركة المصنعة.
         ملاحظة: يتم استخدام محلول سترات الصوديوم المالحة (SSC) 10x أو 20x كمخزن مؤقت للنقل. بشكل عام ، 3 ساعات من النقل تكفي لنقل 95٪ من gDNA من الجل إلى الغشاء ؛ ومع ذلك ، فإن وقت النقل الأطول غير ضار.
      7. أخرج الغشاء واغسله ب 2x SSC لمدة 1 دقيقة ، وامتص السائل بالأنسجة ، ثم اربط الحمض النووي بالغشاء باستخدام الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية.
         ملاحظه: يمكن تخزين الغشاء عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.
2. قم بتسمية مجسات الحمض النووي بالنشاط الإشعاعي.
   قم
   1. بتنقية بلازميدات المسبار باستخدام مجموعة miniprep وفقا للبروتوكول المقدم من الشركة المصنعة.
   2. حرر شظايا الحمض النووي للمجسات من ناقل البلازميد بواسطة هضم EcoR I في محلول تفاعل بما في ذلك 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت ل EcoR I ، و 2 ميكرولتر من إنزيم EcoR I ، و 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ، و H₂O حتى 50 ميكرولتر ، لمدة ساعتين.
   3. قم بتشغيل هلام الحمض النووي بنسبة 1٪ لفصل شظايا الحمض النووي للمسبار عن الناقل وتنقية شظايا الحمض النووي للمجسات باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي وفقا للبروتوكول المقدم من الشركة المصنعة.
   4. باستخدام 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي ، قم بقياس تركيز الحمض النووي لشظايا الحمض النووي للمسبار باستخدام مقياس الطيف الضوئي بطول موجي 260/280 نانومتر.
   5. قم بإعداد 40 نانوغرام من الحمض النووي للمسبار في أنبوب سعة 1.5 مل مع 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE ، واتركه يغلي لمدة 3 دقائق ، ثم يدور لفترة وجيزة ، ثم ضع الأنبوب (الأنبوب) على الجليد لمدة دقيقتين.
   6. أضف الحمض النووي للمسبار المشوه بالحرارة إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبات وضع العلامات على الحمض النووي الجاهزة للاستخدام (-dCTP) ، وقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل للخلط ، وأضف 5 ميكرولتر من [^{α 32}P] dCTP ، ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   قم
   7. بتنقية المجسات المصنفة باستخدام الأعمدة الدقيقة G-50 وفقا للتعليمات المقدمة من الشركة المصنعة ، ثم قم بقياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ (اختياري).
قم
3. بتهجين الأغشية (الأغشية) باستخدام المجسات المصنفة.
   1. قبل تهجين الغشاء.
      1. قم بتسخين محلول التهجين مسبقا عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. امزج 20 مل من محلول التهجين الدافئ مسبقا مع 200 ميكروغرام من الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون المسلوق في أنبوب سعة 50 مل.
      2. ضع الغشاء في أنبوب التهجين. أضف محلول التهجين المسبق المختلط إلى أنبوب التهجين. ضعه في فرن التهجين (اضبط الدرفلة ودرجة الحرارة على 42 درجة مئوية) واترك التهجين المسبق يستمر لمدة 30 دقيقة.
   قم
   2. بتهجين الغشاء باستخدام المسبار (المسبارات) المسمى.
      1. أخرج أنبوب التهجين واسكب محلول التهجين المسبق في أنبوب سعة 50 مل ؛ أضف المسبار المشوه (يسخن عند 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) من الخطوة 2.1.2.7 إلى هذا الأنبوب ويخلط برفق.
         ملاحظه: قلل من أي فقاعات محفزة.
      2. أعد المحلول المختلط إلى أنبوب التهجين وقم بإجراء التهجين عند 42 درجة مئوية طوال الليل.
4. اغسل الأغشية (الأغشية) لإزالة المجسات غير المهجنة.
   1. ضع الأغشية (الأغشية) في صينية بها 1x SSC + 0.1٪ SDS ورج برفق عند 55-60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. انقل الأغشية (الأغشية) إلى صينية بها 0.5x SSC + 0.1٪ SDS ورجه برفق عند 55-60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   3. تحقق من النشاط الإشعاعي على الأغشية (الأغشية) باستخدام عداد جيجر محمول لتحديد ما إذا كان الغسيل الثالث مطلوبا أم لا.
5. تعريض النشاط الإشعاعي على الغشاء لأفلام الأشعة السينية.
   1. قم بإزالة السائل من الأغشية المغسولة.
   قم
   2. بطي الأغشية (الغشاء) بغلاف بلاستيكي وقم بإصلاحه / تثبيتها في شريط التعريض الضوئي.
   3. قم بتعريض الغشاء لورقتين من فيلم الأشعة السينية في غرفة مظلمة.
   4. ضع علبة التعريض الضوئي عند -80 درجة مئوية طوال الليل أو لفترة أطول.
6. تطوير الأفلام لتصور النتائج. قم بتقييم ما إذا كان استنساخ ES المقابل هو المطلوب مع إعادة التركيب المستهدف أم لا ، وفقا لأحجام نطاقات الحمض النووي التي تم اكتشافها بواسطة المجسات.
7. أعد تهجين نفس الغشاء بمسبار آخر بعد تجريد المسبار المستخدم وفقا للإجراء التالي: أخرج الغشاء المستخدم ، واغسله 1x باستخدام H₂O النظيف ، ثم احتضنه في محلول شريطي (55٪ فورماميد ، 2٪ SSPE ، 1٪ SDS ،_{H 2}O) عند 65 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة 1-2 ساعة.

Materials

QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
DNA Denaturing Solution	VWR	351-013-131
DNA Neutralizing Solution	VWR	351-014-131
EcoR I	Thermo Scientific	ER0271
Dra I	Thermo Scientific	ER0221
ProbeQuan G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution	Millipore	S4040
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)	VWR	27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Thermo Fisher	15557036
Salmon Sperm DNA Solution	Thermo Fisher	15632011
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits	Fisher Scientific	09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer	NEG013H100UC
Kodak X-Ray Film	Z&Z Medical	844 5702
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Nuclei Lysis Solution	Promega	A7941
Protein Precipitation Solution	Promega	A7951