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Abstract

Fuente: Tirumalai, V., et al. Análisis de transferencia de ARN para la detección y cuantificación de microARN vegetales. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el northern blot, una técnica de hibridación para detectar y cuantificar microRNAs (miRNAs) a partir de ARN total extraído de tejido vegetal.

Protocol

1. Electroforesis en gel

1. Detenga la pre-ejecución y lave los pocillos antes de cargar la muestra.
2. Calentar las muestras a 98 °C durante 1 min y cargar las muestras calientes en el pocillo utilizando puntas capilares. Inserte la punta en el fondo del pocillo de modo que la muestra ocupe una capa delgada en el pocillo.
3. Carga completa de todas las muestras. Incluye la carga del marcador de década de ARN.
4. Ejecute el gel a 80 V hasta que el tinte azul de bromofenol se corra casi por completo. El azul de bromofenol funciona a 10 pb en un gel de acrilamida desnaturalizante al 15%.

2. Preparación para el electro-blot

1. Corta la membrana de N+nylon a las dimensiones de una placa de vidrio y etiqueta la membrana en la esquina superior derecha con un lápiz HB.
2. Coloque suavemente la membrana sobre la superficie del agua estéril, mirando el lado etiquetado hacia la superficie del agua. Remojar previamente la membrana durante 15 min.
3. Corta 4 pedazos de papel secante I en las dimensiones de una almohadilla de fibra.
4. Prepare el sándwich de gel colocando el lado gris del casete en una bandeja limpia.
5. Humedece previamente la almohadilla de fibra y colócala sobre el casete. Elimina las burbujas de aire.
6. Humedece previamente una hoja de papel secante en 1x TBE y colócala sobre la almohadilla de fibra. Elimine las burbujas de aire enrollando una pipeta de plástico sobre el papel. Coloque otro trozo de papel secante prehumedecido y retire las burbujas de aire.
7. Retire con cuidado el gel del casete en funcionamiento y colóquelo sobre la configuración del sándwich, de modo que la primera muestra de ARN cargada quede hacia la derecha.
8. Sumerja suavemente la membrana previamente empapada en 1x TBE y colóquela sobre el gel, mirando hacia abajo. Extiéndalo para eliminar las burbujas de aire.
9. Sumerge un trozo de papel secante, colócalo sobre la membrana y retira las burbujas de aire. Sumerge otro trozo de papel secante, colócalo sobre el sándwich y elimina las burbujas de aire.
10. Complete el sándwich colocando una almohadilla de fibra prehumedecida sobre la configuración y cerrando firmemente el casete.
11. Coloque el casete transblot en el módulo y llene 1x TBE, pH 8.2, hasta la marca de transferencia.
12. Trasvase a 10 V, toda la noche a 4 °C.
13. Después de la transferencia, coloque la membrana húmeda en una hoja de papel e inmediatamente entrecruce el ARN con la membrana mediante irradiación con luz UV de 254 nm (120.000 μjulios/cm²). La transferencia reticulada puede almacenarse a 4 °C para una mayor hibridación.

3. Preparación de la sonda radiomarcada

1. Diseñar una sonda que sea completamente complementaria al pequeño ARN que se va a detectar.
2. Etiquete la sonda con ƳP32ATP (obtenido de BRIT) en su extremo de 5′ combinando los componentes según la receta proporcionada en la Tabla 1.
3. Incubar la mezcla de reacción anterior a 37 °C durante 30 min.
4. Separe el ƳP32ATP sin etiquetar de la sonda mediante el uso de una columna Sephadex G-25 de acuerdo con el protocolo del fabricante.

4.Hibridación del blot

1. Coloque la transferencia entrecruzada, con el lado del ARN hacia la parte superior, dentro de una botella de hibridación.
2. Mezclar enérgicamente el tampón de hibridación ultrasensible, añadir 10 mL del mismo e incubar el blot dentro de un horno de hibridación mantenido a 35 °C, con rotación.
3. Realizar la prehibridación durante 20 min.
4. Retire la botella del horno y agregue suavemente la sonda etiquetada en el tampón de hibridación.
5. Hibridar el blot a 35 °C, con rotación durante 12 h.
6. Después de la hibridación, transfiera con cuidado la solución de hibridación a un tubo de 15 ml. Esta solución puede almacenarse a 4 °C hasta su reutilización.
7. Realice un lavado rápido de la mancha durante 2 minutos para eliminar el exceso de solución de hibridación agregando 2 tampones SSC más 0,5% SDS. Deseche la solución.
8. Incubar la mancha con 2x tampón SSC más 0,5% SDS durante 35 °C, con rotación durante 30 min.
9. Lavar la mancha de nuevo con tampón SSC 0,5x más SDS 0,5% durante 35 °C, con rotación durante 30 min.
10. Coloque la mancha dentro de una cubierta de hibridación, retire el exceso de tampón y séllela.
11. Expóngalo a una pantalla de generador de imágenes de fósforo libre de radiación durante la noche dentro de un casete.
12. Detecte la señal de hibridación utilizando un generador de imágenes biomoleculares y analice los resultados utilizando un software adecuado.

Tabla 1: Tabla de recetas

Tampón y solución	receta	Comentarios
10 X TBE	Búfer Tris de 0,89 M	pH debe establecerse en 8.2 usando ácido acético
	0.89M Ácido bórico
	EDTA de 30 mM
Mezcla de gel	15% acrilamida-bisacrilamida SOL, 19:1	La mezcla de gel no debe contener cristales de urea
	8M de urea
	1X TBE
Tinte cargado de gel	0,05 % (p/v) de azul de bromofenol	Se debe tener cuidado al manipular formamida desionizada
	0,05 %(p/v) de xileno xianol
	100 % desionizado- formamida
Etiquetado de la sonda	Tampón PNK (10X, 2 μL)	Esta mezcla contiene moléculas radiactivas, este paso debe ser realizado por personal capacitado dentro de un laboratorio radiactivo
	Enzima PNK (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Tampón de lavado – I	2X SSC
	0,5 % (p/v) SDS
Tampón de lavado – II	0.5X SSC
	0,5 % (p/v) SDS
Búfer de extracción – I	0.5X SSC
	0,1 % (p/v) SDS
Búfer de extracción – II	0.1X SSC
	0,1 % (p/v) SDS

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay