Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

דגם orthotopic של סרטן השחלות הצפק ב עכברים immunocompetent עבור In vivo הדמיה ניטור הגידול של המערכת החיסונית גידול

doi: 10.3791/2146 Published: November 28, 2010

Summary

כדי ללמוד

Abstract

רקע: סרטן השחלות מאובחנת בדרך כלל בשלב מתקדם שבו היחס במקרה / הרוגים גבוה ונותר הקטלני ביותר של כל ממאירויות גניקולוגיים בקרב נשים בארה"ב 1,2,3. גידולים הצפק הן הצורות הנפוצות ביותר של סרטן השחלות 4,5 Tg-MISIIR-Tag מהונדס מייצג את מודל העכבר רק באופן ספונטני מפתחת סוג זה של גידולים. Tg-MISIIR-Tag עכברים להביע SV40 הפיכת האזור תחת שליטה של Mullerian מעכבות סוג חומר II קולטן (MISIIR) מקדם הגן 6. קווי מהונדס נוספים זוהו לבטא את transgene תג SV40, אך אינם מפתחים גידולים השחלות. ללא גידול עכברים נוטה להפגין תוחלת החיים האופייני C57Bl / 6 עכברים פוריים. עכברים אלו יכולים לשמש מקבלי allograft syngeneic עבור תאים סרטניים שבודדו Tg-MISIIR-Tag-DR26 עכברים.

המטרה: למרות הגידול הדמיה אפשרי 7, לגילוי מוקדם של גידולים עמוקים מאתגרת בבעלי חיים חיים קטנים. כדי לאפשר מחקרים פרה במודל חיה שלם immunologically לסרטן השחלות הצפק, אנו מתארים במודל עכבר syngeneic עבור סוג זה של סרטן השחלות המאפשר הדמיה in vivo, מחקרים של microenvironment את הגידול ואת התגובה החיסונית הגידול.

שיטות: אנחנו הראשונים נגזר + תג עכבר סרטן תאים קו (MOV1) מן הגידול השחלות ספונטנית שנבצרו נקבה בת 26 בשבוע Tg-MISIIR DR26-Tag. לאחר מכן, אנו ביציבות transduced MOV1 תאים עם וקטור TurboFP635 Lentivirus יונקים המקודד Katushka, מוטציה מרחיקות אדום של חלבון פלואורסצנטי אדום מהים כלנית Entacmaea quadricolor עם עירור / פליטה מקסימום 588/635 ננומטר ב 8,9,10. אנו orthotopically מושתל MOV1 קאט בשחלה 11,12,13,14 שאינם סרטניים Tg-MISIIR-Tag הנשי נוטה עכברים. התקדמות הגידול בעקבות הדמיה אופטית vivo ו microenvironment הגידול נותח על ידי אימונוהיסטוכימיה.

תוצאות: מושתל Orthotopically MOV1 תאים קאט פיתחו גידולים השחלות הצפק. MOV1 גידולים קאט יכול להיות דמיינו ידי in vivo הדמיה עד שלושה שבועות לאחר ההשתלה (איור 1) והם הסתננו עם לויקוציטים, כפי שנצפה ב סרטן השחלות אדם 15 (איור 2).

מסקנות: אנו מתארים מודל orthotopic של סרטן השחלות מתאים בתחום ההדמיה vivo של גידולים מוקדם עקב גבוה-pH יציבות photostability של Katushka ברקמות עמוקות. אנו מציעים להשתמש במודל זה syngeneic הרומן של סרטן שחלות נסיובי עבור במחקרים vivo הדמיה וניטור של המערכת החיסונית ואת immunotherapies הגידול.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תא תרבות

  1. לפני הזרקת תרבות orthotopic, MOV1 תאים קאט, נגזר DR26 גידולים, בבקבוק T175 עד שהם 90% ומחוברות. תוכנית להשתמש 1-5000000 תאים לכל הזרקה, אשר יחייב 1 או 2 T175 צלוחיות.
  2. ביום של הזריקה, לקצור את התאים לקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
  3. לאחר ריכוז התא נקבע, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 גרם X בטמפרטורת החדר.
  4. בעקבות הספין, resuspend התאים יש 1 מיליון 10 מיקרוליטר של PBS סטרילי עם 0.002 M EDTA

2. טרום ניתוח

  1. לפני הניתוח, למלא מזרק אינסולין 3/10cc עם תאים 1,000,000 MOV1-קאט 10 מיקרוליטר של PBS EDTA.
  2. העברת העכבר הרדים isofluorane על כרית חימום. הוסף משחה עין על מנת למנוע התייבשות העין. ואז, מיד להכניס את הראש של החיה למערכת האף קונוס מחובר מאדה isoflurane לספק הרדמה במהלך הניתוח.
  3. לאחר חיטוי של הזריקה עם מטליות אלכוהול, תת עורי להזריק 5 מ"ג / ק"ג של Ketoprofen, משכך כאבים טרום ניתוחית, עם מזרק אינסולין 3/10cc.
  4. בעזרת קוצץ, לגלח את החלק השמאלי של הזנב dorsum מצומת thoracolumbar לבסיס של הזנב בעלי חיים. החל קרם להסרת שיער להסיר לחלוטין את השיער. לאחר מכן, להסיר את עודפי עם מגבת נייר רטובה.
  5. פעם את השיער הוסר, לחטא את האזור מגולח עם יוד povidone ו מטליות אלכוהול. ואז, במקום לעטוף כירורגית סביב האזור של החתך.

3. כירורגיה

  1. ממש לפני הניתוח, להתאים את רמות מאדה isoflurane ל -1.5%.
  2. ודא כי בעל החיים הוא מורדם לחלוטין על ידי צובט את כרית כף הרגל.
  3. בשלב הבא, לאתר את הטחול מתחת לעור. ואז באמצעות מספריים כירורגית, לעשות חתך דורסולטרלי 1-2 ס"מ בפינה הימנית העליונה של הטחול.
  4. מנתחים את retroperitoneum. כרית המקיף את השחלה עכבר יקויימו. שימוש במלקחיים מעוקל לתפוס ולחשוף את כרית השומן המקיף את השחלה העכבר.
  5. איבר מימה עם כמה טיפות של PBS סטרילית.
  6. שימוש במלקחיים מעוקל לתפוס, לסגת ... עמדה ... ואז לאבטח את השחלה להזרקה
  7. אמנם אוחז בחוזקה את השחלה עם המלקחיים, להזריק 10 מיקרוליטר של קאט MOV1 תאים סרטניים לתוך השחלה. הבנה טובה תמנע זליגת נוזל או regurgitation.
  8. מיד לאחר ההזרקה, לשחרר את המתח המופעל על ידי מלקחיים. ניקוב בשחלה צריך ספונטני לחזור ולסגור.
  9. שימוש תפר חומצה נספגים Polyglycolic מחוברת מחט, לסגור את הפצע רטרו הצפק.
  10. שחרר את החיה מן חרוט האף.
  11. למתוח את העור לאטום את קצוות הפצע דורסולטרלי עם כמה טיפות של דבק רקמות.
  12. לבסוף, בעל פה לנהל 100 מיקרוליטר של אנטיביוטיקה לחיה. ואז למקם אותו לכלוב שלו לפקח על ההתאוששות. שמור על בעלי חיים על אנטיביוטיקה במי השתייה למשך שבוע.

4. Vivo הדמיה

  1. שבוע לאחר ההזרקה orthotopic של קאט MOV1 תאים סרטניים, לבצע הדמיה vivo. בגין על ידי העברת העכבר הרדים isofluorane לחדר ההדמיה.
  2. הפעל את רמת מאדה isoflurane עד 2%.
  3. בצע in vivo הדמיה בהתאם להוראות מערכת הדמיה של היצרן. בסרטון זה, המערכת לומינה ישמש.
  4. לתמונה, לחץ על תמונה Living תוכנה סמל בשולחן העבודה. ואז, על לוח הבקרה רכישת IVIS, בחר "אתחול". ההגדרות הן מכשיר מקביל הגדרות המצלמה
  5. בלוח הבקרה רכישת להגדיר פרמטרים הרכישה של המכשיר. לגבי הקרינה, המחאה "פלורסנט". לחץ על תיבת צילום לרכוש תמונה עם כל תמונה.
  6. לאחר מכן, לקבוע את זמן החשיפה כפי אוטומטי. תחת "binning פיקסל או CCD ברזולוציה", לבדוק "בינוני". אז תחת F / להפסיק או הצמצם, לבדוק את הערך של 2. הבא, בחר את המסנן עירור 535 ואת מסנן פליטה DsRed.
  7. תחת שדה הראיה, לחץ על View B לתמונה עכבר אחת.
  8. לאחר מכן, לחץ על לרכוש כדי להתחיל את רכישת התמונה.
  9. לאחר רכישת התמונה הושלמה, השתמש אזור ריבית, או החזר על ההשקעה, כלי למדוד את האות. לחץ על הסמל מדידה לשחרר את ערכי האות אזור.
  10. לבסוף, לחצו על "שמור" כדי לשמור את התמונה בתיקיית המשתמש
  11. אחרי התמונות נשמרו, להפסיק את מתן isoflurane ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה. העכבר צריך להתעורר מיד.

5. נציג תוצאות

, שימוש בפרוטוקול זה, הגידול in vivo של סרטן השחלות orthotopic ניתן לנטר לפחות 3 שבועות באמצעות הליך פולשני.

איור 1
באיור 1. MOV1 תאים קאט, או PBS כביקורת שלילית, הוזרקו orthotopically לתוך השחלה הלא סרטניים בעכברים מועדים (חיה הנכון חיה שמאל בהתאמה). In vivo הדמיה בוצעה 2 שבועות מאוחר יותר. פליטת הקרינה הנוצר על ידי תאים MOV1 קאט engrafted בשחלה היה נמדד בהשוואה מהעכבר בקרה שלילית.

איור 2
איור 2. סעיפים קפואים של MOV1 גידולים קאט השחלות הוכתמו אנטי CD4 biotinylated MAB ואחריו המצע DAB (חום כהה) כדי לזהות לימפוציטים חדירה הגידול (חץ שחור). תאים היו counterstained עם מתיל ירוק לדמיין גרעיני תאים (כחול). תאים סרטניים (חצים אדומים) היו ברורים מורפולוגית מתאי T. השקופית מופיע בהגדלה 40X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניתוח וזריקות orthotopic

הזרקת orthotopic בבורסה השחלות דרישות הכשרה דיוק. כך

  1. במקרה של עניים בפועל כירורגית ניסיון, עם גופות הראשון.
  2. השתמש מעדיפים נקבות multiparous (אחד או שניים המלטות) כאשר הם מפתחים השחלות יותר לאורך זמן אשר מאפשר הזרקה והישרדות להגדיל להשוות עם נקבות nulliparous.
  3. בשל גודלו הקטן של בורסה השחלות העכבר, להשתמש בגודל הקטן ביותר את המחט זמין הוא מומלץ מאוד.

בשנת vivo הדמיה

  1. השתמש תמיד התייחסות הקרינה, כגון צינור 1.5 ependorf מ"ל מלאים יוני 10 - יולי 10 MOV1 תאים קאט μl 100 ל 1ml של PBS.
  2. להאכיל את החיות עם דיאטה, אספסת חינם להפחית רקע פלואורסצנטי.
  3. בזהירות לגלח את החיה לפני in vivo הדמיה כדי להפחית את הרקע.

משמעות

מודל זה syngeneic של סרטן השחלות הצפק בחיות immunocompetent כי מוזרקים orthotopically עם הרחוק אדום ניאון בתאי סרטן השחלות (MOV1 קאט) היתרי מחקרים פרה להעריך אסטרטגיות חדשניות הדמיה וטיפול מוקדם של גידולים, כאשר המחלה עדיין ניתנת לטיפול, כמו גם כמו ניטור vivo של המערכת החיסונית ואת immunotherapies הגידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH P01-AI 068,730 (SNC, NS), המענק NIH CA016520 / TAPITMAT (NS), את המימון הפרטי מקרן Claneil (NS), ואת השחלות נבג להעניק FCCC ואת אוניברסיטת פנסילבניה ( P50 CA83638) ואת פוקס צ'ייס Cancer Center Core גרנט (P30 CA06927) (DCC). המחברים מודים סיוע טכני מעולה של Core מתקן אופטי / פליטת אור בהנהלת ד"ר EJ Delikatny באוניברסיטת פנסילבניה, אנתוני סקרטו מתא גזע Core xenograft בהנהלת ד"ר ג Danet-דסנוייה באוניברסיטת פנסילבניה סרטן המרכז SNC הכשרה לטכניקה הזרקה orthotopic ו Denada Dangaj באוניברסיטת פנסילבניה / OCRC לסיוע על הניתוח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-GLUTAMAX Invitrogen 10564-011
PBS GIBCO, by Life Technologies 14040
Versene Lonza Inc. 17-711E
Heating pad Deltaphase 39 DP
Povidone pads Dynarex 1108
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 17845-153
Ketoprofen Fort Dodge Animal Health
3cc/insulin syringe BD Biosciences 309301
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) Syneture 9612-31
Tissue adhesive Vetbond 3M
Vet Bactrim/ oral suspension Hi-tech Pharmacal 840823
IVIS-Lumina Caliper Life Sciences
Isofluorane Phoenix Pharmaceuticals, Inc. J108013
Fetal Bovine Serum, Qualified Invitrogen 10437036
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
TurboFP635 mammalian vector Evrogen FP721
T175 flasks cellstar 660-190

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etzioni, R. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
  2. Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
  3. Anderson, G. L. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
  4. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
  5. Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
  6. Connolly, D. C. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
  7. Hensley, H. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
  8. Deliolanis, N. C. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
  9. Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
  10. Shcherbo, D. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
  11. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
  12. Kiguchi, K. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis. 16, 751-756 (1998).
  13. Bao, R. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
  14. Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology. 45, 1-36 (2009).
  15. Milne, K. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. PLoS ONE. 4, (2009).
דגם orthotopic של סרטן השחלות הצפק ב עכברים immunocompetent עבור<em> In vivo</em> הדמיה ניטור הגידול של המערכת החיסונית גידול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).More

Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter