Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Summary

Para estudar

Abstract

Antecedentes: O câncer de ovário é geralmente diagnosticada em fase avançada, onde a relação caso / fatalidade é alta e assim continua a ser o mais letal de todas as neoplasias malignas ginecológicas entre os EUA as mulheres ^1,2,3. Tumores serosos são as formas mais generalizadas de câncer de ovário e de ^4,5 a transgênicos Tg-MISIIR-Tag representa o modelo do rato só que espontaneamente se desenvolve este tipo de tumores. Tg-MISIIR-Tag ratos expressar SV40 região transformando sob o controle do mülleriano Substância Inibidora tipo II Receptor (MISIIR) promotor do gene ^6. Adicionais linhagens transgênicas foram identificadas que expressam o transgene TAG SV40, mas não desenvolvem tumores de ovário. Não-tumor ratos propensos apresentam vida útil típica de camundongos C57BL / 6 e são férteis. Estes ratos pode ser usado como destinatários aloenxerto singeneicos para células tumorais isoladas de Tg-MISIIR-Tag-DR26 camundongos.

Objetivo: Apesar de imagem do tumor é possível ^7, a detecção precoce de tumores profundos é um desafio em animais vivos de pequeno porte. Para habilitar estudos pré-clínicos em modelos animais imunologicamente intacto para o câncer de ovário seroso, descrevemos um modelo de camundongo singeneicos para este tipo de câncer de ovário que permite in vivo de imagens, os estudos do microambiente do tumor e tumor respostas imunes.

Métodos: Nós primeiro derivou uma Tag + mouse linha de células de câncer (MOV1) a partir de um tumor de ovário espontâneas colhidas num 26 semanas de idade, do sexo feminino Tg-DR26 MISIIR-TAG. Então, nós estável transduzidas MOV1 células com TurboFP635 vector Lentivirus mamíferos que codifica Katushka, um mutante vermelho-distante da proteína fluorescente vermelha do mar anemone Entacmaea quadricolor com excitação / emissão em 588/635 nm maxima ^8,9,10. Nós ortotopicamente implantado MOV1 ^Kat no ovário ^11,12,13,14 de não-tumor propensas Tg-MISIIR-Tag feminino ratos. Progressão do tumor foi seguido por em imagens ópticas vivo e microambiente do tumor foi analisado por imunohistoquímica.

Resultados: ortotopicamente implantado MOV1 células ^Kat desenvolveram tumores de ovário seroso. Tumores MOV1 ^Kat pode ser visualizado por in vivo de imagens até três semanas após o implante (fig. 1) e foram infiltradas com leucócitos, como observado nos cânceres de ovário humano ¹⁵ (fig. 2).

Conclusões: Descrevemos um modelo ortotópico de câncer de ovário adequado para a imagem in vivo de tumores no início devido ao alto pH de estabilidade e fotoestabilidade de Katushka em tecidos profundos. Propomos o uso deste novo modelo singeneicos de câncer de ovário seroso para estudos de imagem in vivo e monitoramento de tumor respostas imunes e imunoterapias.

Protocol

1. Cultura de células

1. Antes da injeção ortotópico, cultura MOV1 ^Kat células, derivadas de tumores DR26, em um frasco T175 até que sejam 90% confluentes. Planeja usar 1-5000000 células por injeção, o que exigirá um ou dois frascos T175.
2. No dia da injeção, a colheita das células e determinar o número de células usando um hemocitômetro.
3. Uma vez que a concentração celular foi determinada, agregar as células por centrifugação por 5 minutos a 300 X g à temperatura ambiente.
4. Após a rodada, ressuspender as células de ter 1 milhão em 10 microlitros de PBS estéril com EDTA 0,002 M

2. Pré-operatório

1. Antes da cirurgia, encher uma seringa de insulina 3/10cc com 1 milhão de ^MOV1-Kat células em 10 microlitros de PBS EDTA.
2. Transferência de um rato anestesiado com isofluorano uma almofada de aquecimento. Adicionar pomada para evitar a desidratação olho. Então, imediatamente inserir a cabeça do animal em um sistema de cone do nariz ligado a um vaporizador isoflurano para entregar toda a anestesia da cirurgia.
3. Após a desinfecção do local de injecção com álcool, por via subcutânea injetar 5 mg / kg de cetoprofeno, um analgésico pré-cirúrgico, com uma seringa de insulina 3/10cc.
4. Usando tosquiadeiras, raspar a parte esquerda caudal do dorso da junção tóraco-lombar à base da cauda dos animais. Aplique o creme de depilação para remover completamente o cabelo. Em seguida, retire o excesso com uma toalha de papel molhado.
5. Uma vez que o cabelo tenha sido removido, esterilizar a área depilada com iodopovidona e compressas com álcool. Em seguida, coloque uma cortina cirúrgica ao redor da área de incisão.

3. Cirurgia

1. Pouco antes da cirurgia, ajustar os níveis de vaporizador isoflurano para 1,5%.
2. Verifique se o animal está completamente anestesiado por beliscar a almofada de pé.
3. Em seguida, localize o baço sob a pele. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão dorsolateral 1-2 cm de comprimento na parte superior direita do baço.
4. Dissecar o retroperitônio. A almofada em torno do ovário do mouse será observado. Use uma pinça curva de compreender e expor a almofada de gordura ao redor do ovário mouse.
5. Órgão o hidrato com algumas gotas de PBS estéril.
6. Use uma pinça curva de captar, recolher ... posição ... e depois prenda o ovário para injecção
7. Enquanto segurando firmemente o ovário com a pinça, injectar 10 microlitros de MOV1 células tumorais ^Kat no ovário. Um aperto firme irá impedir a regurgitação ou vazamento de fluido.
8. Imediatamente após a injeção, liberar a tensão exercida pelo fórceps. A perfuração no ovário deve retrair-se espontaneamente e fechar.
9. Usando um fio absorvível de ácido poliglicólico ligado a uma agulha, fechar a ferida retro-peritônio.
10. Solte o animal do cone do nariz.
11. Esticar a pele e selar as bordas da ferida dorsolateral com algumas gotas de cola de tecido.
12. Finalmente, por via oral, administrar 100 microlitros de antibióticos para o animal. Em seguida, coloque-o de volta em sua gaiola e monitor para recuperação. Manter o animal em uso de antibióticos na água de beber por uma semana.

4. In vivo de imagens

1. Uma semana após a injeção ortotópico de MOV1 células tumorais ^Kat, executar em imagem in vivo. Comece por transferir um mouse isofluorano anestesiados para a câmara de imagem.
2. Por sua vez o nível de vaporizador isoflurano até 2%.
3. Realizar in vivo de imagens de acordo com as instruções do fabricante do sistema de imagem. Neste vídeo, o sistema será usado Lumina.
4. A imagem, clique na imagem viva ícone no desktop software. Em seguida, no Painel de Controle Aquisição IVIS, selecione "Inicializar". As configurações são instrumento análogo a uma as configurações da câmera
5. No Painel de Controle aquisição configurar os parâmetros do instrumento de aquisição. Para fluorescência, marque "Fluorescent". Clique na caixa de Fotografia para adquirir uma fotografia com cada imagem.
6. Em seguida, defina o tempo de exposição como Auto. Em "binning Pixel CCD ou resolução", marque "Medium". Então Sob F / stop ou abertura, verifique o valor de 2. Em seguida, selecione o filtro de excitação 535 e do filtro de emissão DsRed.
7. Sob campo de visão, clique em View B para a imagem de um rato.
8. Em seguida, clique em adquirir para iniciar a aquisição da imagem.
9. Uma vez que a aquisição da imagem está completa, use a região de interesse, ou ROI, ferramenta para medir do sinal. Clique no ícone de medição para liberar os valores do sinal e área.
10. Por fim, clique em "save" para salvar a imagem na pasta de usuário
11. Depois que as imagens foram salvas, interrompa a administração de isoflurano e retornar o mouse para sua gaiola. O mouse deve acordar imediatamente.

5. Resultados representante

-Usando este protocolo, O crescimento in vivo de um câncer de ovário ortotópico pode ser monitorado por pelo menos 3 semanas usando um procedimento não-invasivo.

Figura 1. MOV1 células ^Kat, ou PBS como controle negativo, foram ortotopicamente injetado no ovário de não-tumor ratos propensos (animal direita e esquerda e animais, respectivamente). In vivo de imagem foi realizado duas semanas mais tarde. A emissão de fluorescência gerada por células MOV1 ^Kat enxertada no ovário foi medida e comparada com a de rato controle negativo.

Figura 2. Seções congeladas de MOV1 tumores ovarianos ^Kat foram coradas com biotinilado anti-CD4 mAb seguido pelo substrato DAB (marrom escuro) para detectar tumor infiltrando linfócitos (seta preta). As células foram contracorados com metil-verde para visualizar núcleos celulares (azul). Células tumorais (setas vermelhas) foram morfologicamente distintas de células T. O slide aparece ampliado 40x.

Discussion

Cirurgia e injeções ortotópico

Injeção ortotópico em bursa ovariana demandas de treinamento e precisão. Assim

1. Em caso de pobres cirúrgica experiência prática, com cadáveres em primeiro lugar.
2. Use preferencialmente mulheres multíparas (um ou dois litros) como elas se desenvolvem ovários maiores ao longo do tempo que facilita a injeção e no aumento de sobrevida para comparar com as fêmeas nulíparas.
3. Devido ao pequeno tamanho da bursa ovariana mouse, o uso do menor tamanho de agulha disponível é fortemente encorajada.

In vivo de imagens

1. Use sempre uma referência para fluorescência, como um tubo de 1,5 ml Ependorf preenchido com ¹⁰ junho - 10 julho MOV1 células ^kat em 100 ml a 1 ml de PBS.
2. Alimentar os animais com alfafa dieta livre de reduzir o fundo de fluorescência.
3. Cuidadosamente raspar o animal antes in vivo de imagens para reduzir fundo.

Significado

Este modelo singeneicos de câncer de ovário seroso em animais imunocompetentes que são injetados com ortotopicamente Far-vermelho células ovarianas fluorescentes câncer (MOV1 ^KAT) permite estudos pré-clínicos para avaliar novas estratégias para a imagem latente e terapia de tumores iniciais, quando a doença ainda é tratável, bem como monitorização in vivo de tumor respostas imunes e imunoterapias.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-GLUTAMAX	Invitrogen	10564-011
PBS	GIBCO, by Life Technologies	14040
Versene	Lonza Inc.	17-711E
Heating pad	Deltaphase	39 DP
Povidone pads	Dynarex	1108
Alcohol pads	Fisher Scientific	06-669-62
Artificial tears ointment	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	17845-153
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
3cc/insulin syringe	BD Biosciences	309301
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm)	Syneture	9612-31
Tissue adhesive	Vetbond	3M
Vet Bactrim/ oral suspension	Hi-tech Pharmacal	840823
IVIS-Lumina	Caliper Life Sciences
Isofluorane	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	J108013
Fetal Bovine Serum, Qualified	Invitrogen	10437036
Penicillin/streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
TurboFP635 mammalian vector	Evrogen	FP721
T175 flasks	cellstar	660-190