Summary
Для изучения
Protocol
1. Культуре клеток
- Перед ортотопической инъекции, культуры MOV1 Kat клетки, полученные из DR26 опухолей, в T175 колбу, пока они не 90% вырожденная. План использования от 1 до 5 миллионов клеток на инъекцию, для чего потребуется 1 или 2 T175 колб.
- В день инъекции, урожай клеток и определить номер ячейки использованием гемоцитометра.
- Как только концентрации клеток было определено, пеллет клетки центрифугированием в течение 5 минут при 300 Х г при комнатной температуре.
- После спина, ресуспендируют клетки иметь 1 миллион в 10 мкл стерильной PBS с 0,002 М ЭДТА
2. Предварительно хирургии
- До операции, пополнить 3/10cc шприц инсулина с 1 млн. MOV1-Кат клеток в 10 мкл PBS ЭДТА.
- Передача isofluorane наркозом мыши грелку. Добавить глазную мазь, чтобы предотвратить обезвоживание глаз. Затем сразу же вставить голову животного в системе носового конуса связаны с изофлуран испарителя доставить анестезии всей операции.
- После дезинфекции место инъекции спиртом тампоны, подкожно вводят 5 мг / кг Кетопрофен, предоперационная болеутоляющее, с 3/10cc шприц инсулина.
- Использование кусачки, бриться левой хвостовой части спинки от грудопоясничного перехода к основанию хвоста животного. Нанесите крем удаления волос для полного удаления волос. Затем удалите излишки с мокрым бумажным полотенцем.
- Как только волосы были удалены, стерилизовать бритой области с повидон-йодом и спиртом тампоны. Затем поместите хирургических драпировать вокруг области разреза.
3. Хирургия
- Незадолго до операции, регулировать уровни изофлуран испаритель до 1,5%.
- Убедитесь, что животное полностью под наркозом, зажимая ногу площадку.
- Затем найдите селезенки под кожей. Затем, используя хирургические ножницы, чтобы дорсолатеральной разрез 1-2 см в длину на правой верхней части селезенки.
- Рассеките забрюшинного пространства. Площадку окружающих мыши яичников будет наблюдаться. Использование изогнутых щипцов для восприятия и подвергать жировой ткани окружающие мыши яичника.
- Гидратов орган с несколько капель стерильного PBS.
- Использование изогнутых щипцов для понимания, убрать ... Позиция ... и затем закрепите яичников для инъекций
- Решительно схватив яичника с щипцами, вводят 10 мкл MOV1 клетки Kat опухоли в яичниках. Твердое понимание позволит предотвратить срыгивание жидкости или утечки.
- Сразу же после инъекции, снять напряжение со стороны щипцами. Перфорация в яичнике должно спонтанно отказаться и закрыть.
- Использование рассасывающиеся нити кислота полигликолевой прилагается к игле, рядом ретро-брюшины раны.
- Выпуск животного от носа конус.
- Натяжные кожи и печатью дорсолатеральной краев раны с несколькими каплями клея ткани.
- Наконец, устно управлять 100 мкл антибиотики для животных. Затем поместите его обратно в клетку и монитор для восстановления. Держите животное на антибиотики в питьевой воде в течение одной недели.
4. В естественных изображений
- Через неделю после ортотопической инъекции MOV1 клетки Kat опухоль, выполняют в области обработки изображений естественных условиях. Начните с передачи isofluorane наркозом мыши изображения камеры.
- Включите изофлуран уровня испарителя до 2%.
- Выполните в естественных изображений в соответствии с инструкциями изготовителя изображения системы. В этом видео, системы Lumina будет использоваться.
- Чтобы создать образ, нажмите живой образ программного обеспечения на рабочем столе. Затем, на панели управления Приобретение ИВИС, выберите "Initialize". Настройки прибора аналогичны настройки камеры
- На панели управления приобретение создана приобретение инструмента параметров. Для флуоресценции, установите флажок "Лампа дневного света." Нажмите Фотография поле, чтобы приобрести фотографии с каждого изображения.
- Далее, установите выдержку как Auto. В разделе "Pixel биннинга или CCD разрешение", установите флажок "Medium". Тогда в F / стоп или диафрагмы, проверьте значение 2. Далее, выберите фильтр 535 возбуждения и DsRed фильтра выбросов.
- Под полем зрения, щелкните по View B имиджу одной мыши.
- Затем нажмите на приобретение, чтобы начать захвата изображений.
- После получения изображения завершена, использования области интереса, или ROI, инструмент для измерения сигнала. Нажмите на иконку для измерения выпуска значений сигнала и области.
- Наконец, нажмите кнопку "Сохранить" для сохранения изображения в папке пользователя
- После того, как изображения были сохранены, остановить администрации изофлуран и вернуть мышь в клетку. Мышь должна проснуться немедленно.
5. Представитель Результаты
-С помощью этого протокола, В естественных условиях роста из ортотопической рака яичников можно наблюдать в течение 3 недель, используя неинвазивные процедуры.
Рисунок 1. MOV1 Kat клеток, или PBS в качестве отрицательного контроля, были orthotopically вводят в яичнике неопухолевой склонны мыши (правая и левая животных и животных соответственно). В естественных изображений была выполнена через 2 недели. Флуоресценции выбросов, полученных от MOV1 клетки Kat привиты в яичнике было измерено и по сравнению с тем, от отрицательных управление мышью.
Рисунок 2. Замороженные разделы MOV1 опухолей яичников Kat окрашивали биотинилированного анти-CD4 мАт следуют DAB подложки (темно-коричневый) для обнаружения опухоли проникают лимфоциты (черная стрелка). Клетки контрастно с метил-зеленый для визуализации клеточных ядер (синий). Опухолевые клетки (красные стрелки) были морфологически отличие от Т-клеток. Слайд появляется увеличенное 40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хирургии и Ортотопическая инъекций
Ортотопическая инъекций в яичниках сумки требует подготовки и точности. Таким образом
- В случае плохой хирургический опыт, практика с трупов в первую очередь.
- Использование преимущественно повторнородящих женщин (один или два помета), как они развивают большую яичников в течение долгого времени, что облегчает введение и увеличение выживаемости для сравнения с нерожавших женщин.
- Из-за небольшого размера сумки яичника мыши, использованием наименьшего доступного размера иглы настоятельно рекомендуется.
В естественных изображений
- Всегда используйте ссылки для флуоресценции, например, 1,5 мл ependorf трубки, заполненной 10 6 до 10 7 MOV1 кат клеток в 100 мкл на 1 мл PBS.
- Поток животных с люцерной без диеты, чтобы уменьшить флуоресценции фон.
- Тщательно бритья животных в естественных условиях до отображения, чтобы уменьшить фон.
Значение
Это сингенных модель серозного рака яичников у иммунокомпетентных животных, которые orthotopically вводили дальнего красного флуоресцентного клеток рака яичников (MOV1 KAT) позволяет доклинических исследований по оценке новых стратегий для работы с изображениями и лечения ранних опухолей, когда болезнь еще поддается лечению, а также как и в естественных условиях мониторинга опухолевых иммунный ответ и иммунотерапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант P01 А.И. 068730 (SNC, Н. С.), грант NIH CA016520 / TAPITMAT (NS), частное финансирование из Фонда Claneil (NS) и яичников SPORE предоставить РКИК и Университета Пенсильвании ( P50 CA83638) и Fox Chase Cancer Center Основные Грант (P30 CA06927) (ДКК). Авторы выражают благодарность отличном техническом содействии оптический / Биолюминесценция Основные фонда направлено доктором Э. Delikatny в Университете Пенсильвании, Энтони Secreto из стволовых клеток и ксенотрансплантата Основные режиссера д-р Г. Дане-Денуайе в Университете Пенсильвании рака Центр подготовки к SNC ортотопической технике инъекций и Denada Dangaj в Университете штата Пенсильвания / ОЦРК для оказания помощи по хирургии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| Heating pad | Deltaphase | 39 DP | |
| Povidone pads | Dynarex | 1108 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| 3cc/insulin syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| Tissue adhesive | Vetbond | 3M | |
| Vet Bactrim/ oral suspension | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| Isofluorane | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Invitrogen | 10437036 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| TurboFP635 mammalian vector | Evrogen | FP721 | |
| T175 flasks | cellstar | 660-190 |
References
- Etzioni, R., et al. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
- Anderson, G. L., et al. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev 22. , 255-288 (2001).
- Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
- Connolly, D. C., et al. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
- Hensley, H., et al. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
- Deliolanis, N. C., et al. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
- Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
- Shcherbo, D., et al. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
- Kiguchi, K., et al. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis 16. , 751-756 (1998).
- Bao, R., et al. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
- Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology 45. , 1-36 Forthcoming.
- Milne, K., et al. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. , (2009).
