Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ортотопическая Модель серозного рака яичников у иммунокомпетентных мышей для В естественных условиях Опухоль изображений и мониторинг иммунного ответа опухоли

doi: 10.3791/2146 Published: November 28, 2010

Summary

Для изучения

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Культуре клеток

  1. Перед ортотопической инъекции, культуры MOV1 Kat клетки, полученные из DR26 опухолей, в T175 колбу, пока они не 90% вырожденная. План использования от 1 до 5 миллионов клеток на инъекцию, для чего потребуется 1 или 2 T175 колб.
  2. В день инъекции, урожай клеток и определить номер ячейки использованием гемоцитометра.
  3. Как только концентрации клеток было определено, пеллет клетки центрифугированием в течение 5 минут при 300 Х г при комнатной температуре.
  4. После спина, ресуспендируют клетки иметь 1 миллион в 10 мкл стерильной PBS с 0,002 М ЭДТА

2. Предварительно хирургии

  1. До операции, пополнить 3/10cc шприц инсулина с 1 млн. MOV1-Кат клеток в 10 мкл PBS ЭДТА.
  2. Передача isofluorane наркозом мыши грелку. Добавить глазную мазь, чтобы предотвратить обезвоживание глаз. Затем сразу же вставить голову животного в системе носового конуса связаны с изофлуран испарителя доставить анестезии всей операции.
  3. После дезинфекции место инъекции спиртом тампоны, подкожно вводят 5 мг / кг Кетопрофен, предоперационная болеутоляющее, с 3/10cc шприц инсулина.
  4. Использование кусачки, бриться левой хвостовой части спинки от грудопоясничного перехода к основанию хвоста животного. Нанесите крем удаления волос для полного удаления волос. Затем удалите излишки с мокрым бумажным полотенцем.
  5. Как только волосы были удалены, стерилизовать бритой области с повидон-йодом и спиртом тампоны. Затем поместите хирургических драпировать вокруг области разреза.

3. Хирургия

  1. Незадолго до операции, регулировать уровни изофлуран испаритель до 1,5%.
  2. Убедитесь, что животное полностью под наркозом, зажимая ногу площадку.
  3. Затем найдите селезенки под кожей. Затем, используя хирургические ножницы, чтобы дорсолатеральной разрез 1-2 см в длину на правой верхней части селезенки.
  4. Рассеките забрюшинного пространства. Площадку окружающих мыши яичников будет наблюдаться. Использование изогнутых щипцов для восприятия и подвергать жировой ткани окружающие мыши яичника.
  5. Гидратов орган с несколько капель стерильного PBS.
  6. Использование изогнутых щипцов для понимания, убрать ... Позиция ... и затем закрепите яичников для инъекций
  7. Решительно схватив яичника с щипцами, вводят 10 мкл MOV1 клетки Kat опухоли в яичниках. Твердое понимание позволит предотвратить срыгивание жидкости или утечки.
  8. Сразу же после инъекции, снять напряжение со стороны щипцами. Перфорация в яичнике должно спонтанно отказаться и закрыть.
  9. Использование рассасывающиеся нити кислота полигликолевой прилагается к игле, рядом ретро-брюшины раны.
  10. Выпуск животного от носа конус.
  11. Натяжные кожи и печатью дорсолатеральной краев раны с несколькими каплями клея ткани.
  12. Наконец, устно управлять 100 мкл антибиотики для животных. Затем поместите его обратно в клетку и монитор для восстановления. Держите животное на антибиотики в питьевой воде в течение одной недели.

4. В естественных изображений

  1. Через неделю после ортотопической инъекции MOV1 клетки Kat опухоль, выполняют в области обработки изображений естественных условиях. Начните с передачи isofluorane наркозом мыши изображения камеры.
  2. Включите изофлуран уровня испарителя до 2%.
  3. Выполните в естественных изображений в соответствии с инструкциями изготовителя изображения системы. В этом видео, системы Lumina будет использоваться.
  4. Чтобы создать образ, нажмите живой образ программного обеспечения на рабочем столе. Затем, на панели управления Приобретение ИВИС, выберите "Initialize". Настройки прибора аналогичны настройки камеры
  5. На панели управления приобретение создана приобретение инструмента параметров. Для флуоресценции, установите флажок "Лампа дневного света." Нажмите Фотография поле, чтобы приобрести фотографии с каждого изображения.
  6. Далее, установите выдержку как Auto. В разделе "Pixel биннинга или CCD разрешение", установите флажок "Medium". Тогда в F / стоп или диафрагмы, проверьте значение 2. Далее, выберите фильтр 535 возбуждения и DsRed фильтра выбросов.
  7. Под полем зрения, щелкните по View B имиджу одной мыши.
  8. Затем нажмите на приобретение, чтобы начать захвата изображений.
  9. После получения изображения завершена, использования области интереса, или ROI, инструмент для измерения сигнала. Нажмите на иконку для измерения выпуска значений сигнала и области.
  10. Наконец, нажмите кнопку "Сохранить" для сохранения изображения в папке пользователя
  11. После того, как изображения были сохранены, остановить администрации изофлуран и вернуть мышь в клетку. Мышь должна проснуться немедленно.

5. Представитель Результаты

-С помощью этого протокола, В естественных условиях роста из ортотопической рака яичников можно наблюдать в течение 3 недель, используя неинвазивные процедуры.

Рисунок 1
Рисунок 1. MOV1 Kat клеток, или PBS в качестве отрицательного контроля, были orthotopically вводят в яичнике неопухолевой склонны мыши (правая и левая животных и животных соответственно). В естественных изображений была выполнена через 2 недели. Флуоресценции выбросов, полученных от MOV1 клетки Kat привиты в яичнике было измерено и по сравнению с тем, от отрицательных управление мышью.

Рисунок 2
Рисунок 2. Замороженные разделы MOV1 опухолей яичников Kat окрашивали биотинилированного анти-CD4 мАт следуют DAB подложки (темно-коричневый) для обнаружения опухоли проникают лимфоциты (черная стрелка). Клетки контрастно с метил-зеленый для визуализации клеточных ядер (синий). Опухолевые клетки (красные стрелки) были морфологически отличие от Т-клеток. Слайд появляется увеличенное 40x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Хирургии и Ортотопическая инъекций

Ортотопическая инъекций в яичниках сумки требует подготовки и точности. Таким образом

  1. В случае плохой хирургический опыт, практика с трупов в первую очередь.
  2. Использование преимущественно повторнородящих женщин (один или два помета), как они развивают большую яичников в течение долгого времени, что облегчает введение и увеличение выживаемости для сравнения с нерожавших женщин.
  3. Из-за небольшого размера сумки яичника мыши, использованием наименьшего доступного размера иглы настоятельно рекомендуется.

В естественных изображений

  1. Всегда используйте ссылки для флуоресценции, например, 1,5 мл ependorf трубки, заполненной 10 6 до 10 7 MOV1 кат клеток в 100 мкл на 1 мл PBS.
  2. Поток животных с люцерной без диеты, чтобы уменьшить флуоресценции фон.
  3. Тщательно бритья животных в естественных условиях до отображения, чтобы уменьшить фон.

Значение

Это сингенных модель серозного рака яичников у иммунокомпетентных животных, которые orthotopically вводили дальнего красного флуоресцентного клеток рака яичников (MOV1 KAT) позволяет доклинических исследований по оценке новых стратегий для работы с изображениями и лечения ранних опухолей, когда болезнь еще поддается лечению, а также как и в естественных условиях мониторинга опухолевых иммунный ответ и иммунотерапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH грант P01 А.И. 068730 (SNC, Н. С.), грант NIH CA016520 / TAPITMAT (NS), частное финансирование из Фонда Claneil (NS) и яичников SPORE предоставить РКИК и Университета Пенсильвании ( P50 CA83638) и Fox Chase Cancer Center Основные Грант (P30 CA06927) (ДКК). Авторы выражают благодарность отличном техническом содействии оптический / Биолюминесценция Основные фонда направлено доктором Э. Delikatny в Университете Пенсильвании, Энтони Secreto из стволовых клеток и ксенотрансплантата Основные режиссера д-р Г. Дане-Денуайе в Университете Пенсильвании рака Центр подготовки к SNC ортотопической технике инъекций и Denada Dangaj в Университете штата Пенсильвания / ОЦРК для оказания помощи по хирургии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-GLUTAMAX Invitrogen 10564-011
PBS GIBCO, by Life Technologies 14040
Versene Lonza Inc. 17-711E
Heating pad Deltaphase 39 DP
Povidone pads Dynarex 1108
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 17845-153
Ketoprofen Fort Dodge Animal Health
3cc/insulin syringe BD Biosciences 309301
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) Syneture 9612-31
Tissue adhesive Vetbond 3M
Vet Bactrim/ oral suspension Hi-tech Pharmacal 840823
IVIS-Lumina Caliper Life Sciences
Isofluorane Phoenix Pharmaceuticals, Inc. J108013
Fetal Bovine Serum, Qualified Invitrogen 10437036
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
TurboFP635 mammalian vector Evrogen FP721
T175 flasks cellstar 660-190

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etzioni, R. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
  2. Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
  3. Anderson, G. L. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
  4. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
  5. Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
  6. Connolly, D. C. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
  7. Hensley, H. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
  8. Deliolanis, N. C. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
  9. Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
  10. Shcherbo, D. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
  11. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
  12. Kiguchi, K. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis. 16, 751-756 (1998).
  13. Bao, R. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
  14. Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology. 45, 1-36 (2009).
  15. Milne, K. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. PLoS ONE. 4, (2009).
Ортотопическая Модель серозного рака яичников у иммунокомпетентных мышей для<em> В естественных условиях</em> Опухоль изображений и мониторинг иммунного ответа опухоли
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).More

Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter