Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immünkompetan Fare Seröz Yumurtalık Kanseri bir Ortotopik Model In vivo Tümör Görüntüleme ve İzleme

doi: 10.3791/2146 Published: November 28, 2010

Summary

Çalışmak için

Abstract

Amaç: Over kanseri, genellikle durumunda / ölüm oranı yüksek bir ileri evrede teşhis ve böylece ABD kadınların 1,2,3 arasındaki tüm jinekolojik maligniteler en ölümcül kalır . Seröz tümörler, yumurtalık kanserinin en yaygın biçimlerinden ve 4,5 Tg-MISIIR-Tag transgenik Bu tip tümörlerin kendiliğinden gelişen tek bir fare modeli temsil eder. Müllerian İnhibitör Madde tip II Reseptör (MISIIR) gen promoter 6 kontrolü altında tg-MISIIR-Tag farelerde ifade SV40 dönüştürerek bölge. Ek transgenik çizgilerle ifade SV40 etiketi transgen tespit edilmiştir, ancak yumurtalık tümörlerinin ortaya çıkmaz. Sigara tümör eğilimli fareler C57BL / 6 fareler için tipik ömrü sergi ve verimli. Bu fareler Tg-MISIIR-TAG-DR26 fareler izole tümör hücreleri için singeneik allogreft alıcısı olarak kullanılabilir.

Amaç: tümör görüntüleme 7 mümkün olsa da, derin tümörleri erken teşhis küçük canlı hayvanlar zorlu. Seröz over kanseri için immünolojik sağlam bir hayvan modelinde preklinik çalışmalarda etkinleştirmek için, in vivo görüntüleme, tümör mikroçevresinin ve tümör immün yanıtları çalışmaları izinleri yumurtalık kanseri bu tip bir singeneik fare modeli açıklanmaktadır .

Yöntem: Biz ilk kez bir 26 hafta eski DR26 Tg-MISIIR-Tag bayan hasat spontan yumurtalık tümörü bir etiket + fare kanser hücre hattı (MOV1) türetilmiştir. Sonra, biz stably Katushka kodlar TurboFP635 lentivirüs memeli vektörü, uyarma / 588 / 635 nm 8,9,10 emisyon maxima ile deniz anemon Entacmaea quadricolor kırmızı floresan proteini çok kırmızı mutant MOV1 hücreleri transduced. Biz orthotopically olmayan tümör eğilimli Tg-MISIIR-Tag dişi farelerde yumurtalık 11,12,13,14 MOV1 Kat implante. Tümör ilerlemesi in vivo optik görüntüleme ve tümör mikroçevresinin immünohistokimyasal analiz edildi izledi.

Sonuçlar: Orthotopically MOV1 Kat hücreler implante seröz over tümörleri geliştirdi. MOV1 Kat tümörler insan over kanseri, 15 (Şekil 2) görüldüğü gibi, üç hafta sonra (Şekil 1) implantasyonu in vivo görüntüleme tarafından görüntülenmiştir olabilir ve lökosit ile infiltre edildi .

Sonuç: Biz derin dokularda pH istikrarı ve yüksek Katushka, fotostabilite nedeniyle erken tümörlerin in vivo görüntüleme için uygun yumurtalık kanseri ortotopik modeli tarif. Tümör immün yanıtları ve Tedaviler in vivo görüntüleme çalışmaları ve izleme için bu romanı seröz over kanseri singeneik modeli öneriyoruz.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hücre Kültürü

  1. Ortotopik enjeksiyon, kültür T175 balon DR26 tümörler türetilen MOV1 Kat hücreleri,% 90 konfluent kadar önce. 1 veya 2 T175 şişeler gerektiren enjeksiyon başına 1 ila 5 milyon hücre, kullanmayı planlıyoruz.
  2. Enjeksiyon gününde, hücrelerin hasat ve hemasitometre kullanarak hücre sayısını belirlemek.
  3. Bir kez oda sıcaklığında 300 X g de 5 dakika santrifüj hücreleri tarafından hücre konsantrasyonu pelet tespit edilmiştir.
  4. Spin sonrasında, 0.002 M EDTA ile steril PBS 10 mikrolitre 1 milyon hücreleri tekrar süspansiyon

2. -Cerrahi öncesi

  1. Ameliyat öncesinde, 1 milyon 10 mikrolitre PBS EDTA MOV1-Kat hücreleri ile bir 3/10cc insülin enjektörü doldurun.
  2. Bir ısıtma yastığı, isofluorane bir anestezi fare aktarın. Göz dehidratasyonu önlemek için göz merhemi ekleyin. Daha sonra, hayvanın başının hemen ameliyat boyunca anestezi sağlamak için bir izofluran buharlaştırıcı bağlı bir burun konisi sistemi içine yerleştirin.
  3. Alkol çubuklar ile enjeksiyon yerinde dezenfeksiyon sonra, subkutan 3/10cc İnsülin şırınga ile 5 mg / kg Ketoprofen, cerrahi öncesi ağrı kesici enjekte.
  4. Kesme makineleri kullanarak, hayvan kuyruk tabanına torakolomber bileşkede dorsum sol kaudal kısmı tıraş. Tamamen saç kaldırmak için saç dökücü krem ​​uygulayın. Sonra ıslak bir kağıt havlu ile fazla çıkarın.
  5. Saç kaldırıldıktan sonra, povidon-iyot ve alkol bezlerden traş alan sterilize edin. Daha sonra, kesi alanı etrafında bir cerrahi örtü koyun.

3. Cerrahi

  1. Cerrahi öncesinde,% 1.5 izofluran buharlaştırıcı seviyelerini ayarlamak.
  2. Hayvan ayak pedi kısma tamamen uyuşturuluyor olduğundan emin olun.
  3. Sonra, cilt altında dalak bulun. Sonra, cerrahi makas kullanarak, dalak sağ üst köşesinde 1-2 cm uzunluğunda bir dorsolateral kesi yapmak.
  4. Retroperiton parçalara ayır. Fare yumurtalık etrafındaki ped görülecektir. Kavisli bir forseps fare yumurtalık çevreleyen yağ yastığı kavramak ve ortaya çıkarmak için kullanın.
  5. Steril PBS birkaç damla Hidrat organ.
  6. Enjeksiyon için yumurtalık, kavramak, geri çekme ... pozisyonu ... ve sonra da güvenliğini sağlamak için kavisli bir forseps
  7. Yumurtalık içine sıkıca forseps ile yumurtalık açgözlü, 10 mikrolitre MOV1 Kat tümör hücreleri enjekte edilir. Bir firma kavramak akışkan yetersizlik veya kaçak önleyecektir.
  8. Enjeksiyonu takiben hemen, forseps tarafından uygulanan gerilim bırakın. Yumurtalık perforasyon kendiliğinden geri çekmek ve kapatmanız gerekir.
  9. Bir iğne takılı bir emilebilir Poliglikolik Asit dikiş kullanarak, retro-peritonda yara kapatın.
  10. Burun konisi hayvan bırakın.
  11. Streç deri ve doku yapıştırıcısı birkaç damla ile dorsolateral yara kenarları mühür.
  12. Son olarak, ağızdan antibiyotik hayvan 100 mikrolitre yönetmek. Daha sonra kurtarma için kafes ve monitör geri yerleştirin. , Bir hafta süreyle içme suyu antibiyotik hayvan tutun.

4. in vivo Görüntüleme

  1. MOV1 Kat tümör hücrelerinin ortotopik enjeksiyon Bir hafta sonra, in vivo görüntüleme gerçekleştirmek. Görüntüleme odasına isofluorane bir anestezi fare transfer ederek başlayın.
  2. % 2 izofluran buharlaştırıcı açın.
  3. In vivo görüntüleme görüntüleme sistemi üreticinin talimatlarına göre yapın. Bu video, Lumina sistemi kullanılacaktır.
  4. Görüntü için, Yaşayan Image yazılımı masaüstü simgesini tıklayın. Sonra IVIS Toplama Kontrol Paneli, "Initialize" seçeneğini seçin. Cihaz ayarları kamera ayarlarını benzer.
  5. Satın Kontrol Paneli cihaz satın parametrelerini ayarlamak. Floresan için, "Floresan" seçeneğini işaretleyin.. Fotoğraf kutusu, her bir görüntü ile fotoğraf elde etmek için tıklayın.
  6. Sonra, pozlama süresi Otomatik olarak ayarlayın. "Piksel binning veya CCD çözünürlüğü" altında, "Orta" kontrol edin. Sonra F / stop veya diyafram altında, 2 değerini kontrol edin. Sonra, 535 eksitasyon filtresi ve DsRed emisyon filtresi seçin.
  7. Görüş alanı altında, tek bir fare görüntü View B tıklayın.
  8. Daha sonra, görüntü elde etme başlamak için kazanmak tıklatın.
  9. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, Faiz Bölgesi, ROI, sinyal ölçüm aracı kullanın. Sinyal değerleri ve alan serbest bırakmak için ölçüm simgesini tıklayın.
  10. Son olarak, kullanıcı klasörüne görüntü kaydetmek için "kaydet" e tıklayın
  11. Görüntüler kaydedildikten sonra, izofluran yönetimini durdurmak fare ve kendi kafesine geri dönmek. Fare hemen uyanmak gerekir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

-Bu protokol, In vivo büyüme ortotopik yumurtalık kanseri, non-invaziv bir prosedür kullanılarak en az 3 hafta boyunca izlenebilir.

Şekil 1
Şekil 1 negatif kontrol olarak MOV1 Kat hücreleri veya PBS, orthotopically olmayan tümör eğilimli farelerde (sırasıyla sağ ve sol hayvan hayvan ve) yumurtalık enjekte edildi, 2 hafta sonra in vivo görüntüleme yapıldı . Yumurtalık engrafted MOV1 Kat hücreleri tarafından üretilen floresans emisyon ölçümleri ve negatif kontrol fare ile karşılaştırıldı.

Şekil 2
Şekil 2 MOV1 Kat over tümörlerinin frozen kesitler mAb DAB substrat (koyu kahverengi) tümör infiltre eden lenfositler (siyah ok) tespit etmek için takip biotinlenmiş anti-CD4 ile boyandı. Hücreler hücre çekirdeği (mavi) görselleştirmek için metil-yeşil ile zıt. Tümör hücreleri (kırmızı ok) T hücreleri morfolojik olarak farklı. Slayt 40x büyütülmüş görünür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cerrahi ve Ortotopik enjeksiyonları

Over bursa Ortotopik enjeksiyon eğitim ve hassasiyet gerektirir. Böylece

  1. Ilk kadavra yoksul cerrahi deneyim, pratik durumda.
  2. Nullipar kadın ile karşılaştırmak için, enjeksiyon ve artış hayatta kalma kolaylaştıran, zaman içinde büyük yumurtalıklar gelişir tercihen multipar kadın (bir ya da iki litre) kullanın.
  3. Fare over bursa küçük boyutları nedeniyle, küçük iğne boyutu kullanımı kesinlikle teşvik edilir.

In vivo görüntüleme

  1. Her zaman için bir referans 1ml PBS ul 100 10 Haziran-10 Temmuz MOV1 kat hücreleri ile dolu bir 1.5 ml ependorf tüp gibi, floresan .
  2. Floresan arka plan azaltmak için yonca diyet ile hayvanları besleyin.
  3. Arka plan azaltmak için dikkatli bir şekilde in vivo görüntüleme önce hayvan tıraş.

Önem

Singeneik modeli orthotopically Uzak-kırmızı floresan yumurtalık kanseri hücreleri (MOV1 KAT) enjekte edilir immünkompetan hayvanlar seröz over kanseri Bu hastalık tedavi edilebilir erken tümörlerin görüntüleme ve tedavi için yeni stratejileri değerlendirmek için preklinik çalışmalarda izin verir, hem de tümör immün yanıtları ve Tedaviler in vivo olarak izlenmesi gibi .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

NIH hibe P01 AI 068.730 (SNC, NS), NIH hibe CA016520 / TAPITMAT (NS), özel finansman Claneil Vakfı (NS), yumurtalık ve FCCC ve Pennsylvania Üniversitesi SPOR hibe (Bu çalışma tarafından desteklenmiştir. P50 CA83638) ve Fox Chase Kanser Merkezi'nde Çekirdek Grant (P30 CA06927) (DCC). Yazarlar Dr. EJ Delikatny yönettiği, Anthony Secreto Pennsylvania Üniversitesi, Pennsylvania Kanser Üniversitesi, Dr. G. Danet-Desnoyers yönettiği Kök Hücre ve Xenograftlarında Çekirdek Optik / Biyoparlaklık Çekirdek Tesisi mükemmel teknik yardım teşekkür ederim Pennsylvania / OCRC Üniversitesi'nde ameliyat yardımcı ortotopik enjeksiyon tekniği ve Denada Dangaj eğitim SNC Merkezi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-GLUTAMAX Invitrogen 10564-011
PBS GIBCO, by Life Technologies 14040
Versene Lonza Inc. 17-711E
Heating pad Deltaphase 39 DP
Povidone pads Dynarex 1108
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 17845-153
Ketoprofen Fort Dodge Animal Health
3cc/insulin syringe BD Biosciences 309301
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) Syneture 9612-31
Tissue adhesive Vetbond 3M
Vet Bactrim/ oral suspension Hi-tech Pharmacal 840823
IVIS-Lumina Caliper Life Sciences
Isofluorane Phoenix Pharmaceuticals, Inc. J108013
Fetal Bovine Serum, Qualified Invitrogen 10437036
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
TurboFP635 mammalian vector Evrogen FP721
T175 flasks cellstar 660-190

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etzioni, R. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
  2. Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
  3. Anderson, G. L. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
  4. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
  5. Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
  6. Connolly, D. C. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
  7. Hensley, H. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
  8. Deliolanis, N. C. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
  9. Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
  10. Shcherbo, D. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
  11. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
  12. Kiguchi, K. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis. 16, 751-756 (1998).
  13. Bao, R. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
  14. Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology. 45, 1-36 (2009).
  15. Milne, K. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. PLoS ONE. 4, (2009).
Immünkompetan Fare Seröz Yumurtalık Kanseri bir Ortotopik Model<em> In vivo</emTümör Bağışıklık Yanıtları> Tümör Görüntüleme ve İzleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).More

Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter