Summary
이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.
Abstract
단백질 - 단백질 상호 작용은 모든 필수 세포 프로세스의 특징입니다. 그러나 이러한 상호 작용의 대부분은 이러한 공동 immunoprecipitation과 같은 전통적인 생화 학적 방법을 통해 자신의 식별 및 분석을 방지, 과도, 또는 정력적 약한 있습니다. 이와 관련, 유전자 encodable 형광 단백질 (GFP, RFP 등) 및 형광 스펙트럼이 중복 관련은 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 1-3을 사용하여 생체내의 약한 상호 작용을 모니터링하는 능력을 혁신합니다. 내피 세포 표면에 수용체 - 수용체의 상호 작용을 모니터링 걱정 기반의 근접 분석의 여기, 우리는 세부의 사용을.
Protocol
프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 포유류의 표현이 아미노 말기 CFP 및 / 또는 YFP의 monomeric 버전 벡터에만 간략하게 논의한다에 관심을 귀하의 유전자의 첫 번째 단계는 복제. 두 번째 및 세 번째 단계, EA.hy926 내피 세포에 벡터 DNA의 transfection과 초조와 공촛점 이미징은 아래에보다 심도있게 설명되어 있습니다.
1. CFP 및 YFP 키메라 수용체의 건설
관심 수용체는 CFP와 YFP의 monomeric 향상된 버전 아미노 말기 복제해야합니다. 안달의 결정은 경험이고 transmembrane이 지역을 걸치는하고 형광단 1 시작 사이의 링커의 길이에 따라 매우 달라집니다. 따라서, 링커의 여러 가지 길이가 조사를 받고 새로운 각 수용체의 쌍에 대한 탐색해야합니다.
- monomeric C 또는 YFP (이 벡터는 우리 실험실에서 얻을 수있다)이있는 pcDNA3.1 hygro R 또는 네오 R 벡터로, NheI / EcoRI 사이트에 관심을 귀하의 수용체를 복제. * 참고 - 필요한 경우, NheI가 SpeI 및 XbaI 포함한 호환 여러 효소이다.
- 적절한 endA1 recA 능력 세포주 (우리가 정기적으로 Mach1 사용)로 결합 반응을 변환. 삽입의 존재를 화면 식민지는 DNA가 변이의 부재를 확인하는 순서로 따라갔다.
- 성공적인 분자 복제의 형태를 취득시, Qiagen, 또는 그와 유사한, DNA 키트를 사용하여 소독 물 또는 TE에 transfection 학년 벡터 DNA를 준비합니다. UV 분광법을 사용하여 농도 및 순도를 평가합니다. DNA의 일반적인 수확량이 정기적으로 1 μg / μL의 작업 주식에 희석는 100-200 μg의 범위에 있어야합니다.
2. EA.hy 926 셀의 Transfection
- MatTek coverslip (제 0) 2 ML 매체로 35mm 요리에 완전한 - DMEM 재배 EA.hy 926 세포 4 (DMEM 10% 태아 소 혈청 + Pen. / Strep.) 분할. 당신은 conservatively 15cm 합류 요리에서 ~ 15 요리 (~ 90 % 합류 다음날)을 얻을 수 있습니다. 각 수용체의 표현뿐만 아니라, 각각의 수용체 쌍을 하나의 요리를 평가 한 접시를 준비합니다.
- 세포 37 5 % CO 2 분위기에서 하룻밤 부화 허용 ° C. 다음날, 문화 ~ 70~90%의 합류해야합니다.
- transfection의 날, 미리 예열 OptiMEM 200 μL에 Fugene6 8 μL와 키메라 수용체 벡터 DNA (2 μL) 2 μg을 혼합하여 nucleolipid 단지를 준비합니다. 2 μg의 총 각 수용체 1 μg과 수용체 쌍 들어, transfect (아래 토론도 참조).
- 역전에 의해 부드럽게 섞는다.
- 30 분 상온에서 부화 계속합니다.
- 잠복기 동안 transfection을 위해 세포를 준비합니다. 신선한 미디어를 대기음 항생제없이 두 ML 사전 예열 완료 - DMEM (DMEM + FBS)의 추가되기 전에 따뜻한 PBS로 부드럽게하고 잠시 각각의 접시를 씻으십시오. 그들이 Fugene6 치료 기간 동안 상당히 많은 독성 세포에 있으므로 페니실린과 스트렙토 마이신의 존재를 방지하는 것이 중요합니다.
- 세포 현명 복잡한 드롭을 추가하고 37 추가 20~24시간에 대한 품어 ° 5 % CO 2 분위기에서 C 있습니다.
- 24 시간 후에 조심스럽게 세포에서 미디어를 대기음 항생제와 함께 신선한 완전한 - DMEM을 피펫. transfection에 따라 세포 생존 능력이 상대적으로 높은 유지한다, 아니 부유 세포 거의가 관찰해야합니다 즉.
- 유전자 발현은 추가 48~60시간 포스트 transfection 후 일반적으로 최대한입니다. 그러나, 영상 24 시간처럼 짧은에서는 일반적으로 가능합니다. 최적의 유전자 발현 시간 코스 실험을 실시하여야한다.
3. 공촛점 이미징 및 분석 걱정
라이브 셀 이미징은 청색 다이오드 (405 nm의), 아르곤 (458, 476, 488, 514 NM)이 장착된 Leica TCS - SP2 AOBS 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 수행됩니다. 녹색 HeNe (543 NM), 오렌지 HeNe (594 NM), 그리고 붉은 HeNe (633 NM) 레이저, HCX PI APO 63x/1.3 나 글리세린 - 침지 목표 렌즈, 전동 XY 스테이지 (Märzhäuser) 및 환경 제어 ( 온도, 습도 및 CO 2) 단계 인큐베이터 (PeCon). 실험 컨트롤 형광단 방출 채널뿐만 아니라 평가하는 표현의 문제가 아닌 특정 형광단의 multimerization 사이의 교차 대화를 제거하는 중요하다. 따라서, 단일 형광단의 transfections는 모든 이미지 세션을 설정 활용하고 있습니다. 부정의 배경을 결정하기 위하여 수행되어야합니다 컨트롤을 (알려진 noninteracting 수용체를 사용하는) 걱정하는 것은 이상의 표현으로 인해 발생되는 무서워.
- CFP와 YFP에 대한 방출 채널 간의 누화를 제거하려면 단계 인큐베이터에 CFP 표현 컨트롤을 놓습니다. 하얀 빛을 사용에 초점을 Z - 플레이트를 조정세포 수 있습니다.
- 465-505 NM 및 YFP 525-600 nm의에로 CFP의 방출 감지 SP 창 설정을 설정합니다.
- 모두 방출 채널을 모니터링하는 동안, 458 nm의에서 CFP를 자극. AOTF를 사용하여 YFP 방출 채널로 CFP 이상의 감지할 수있을 정도의 출혈을 제거하기 위해 레이저 전원을 설정합니다. 이 설정을 저장합니다.
- 단 YFP을 표현 세포에 대한 514 nm의 여기에서 전력을 조정하여 CFP 채널에서 YFP 누화 (YFP 표현 컨트롤을 사용)에 대해 동일한 제어를 수행합니다. 이 설정을 저장합니다.
- 다음 장소 세포 공동 표현 무대 인큐베이터에 CFP와 YFP 있습니다. Leica 공촛점 소프트웨어의 순서 설정을 사용하여 적절한 멤브레인 현지화와 CFP와 YFP 비슷한 수준을 표현하는 세포를 찾습니다.
- Leica 소프트웨어 수용체 사진 표백 프로그램을 사용하여, respectably, 저장된 CFP 및 YFP 설정으로 기증자 및 수용체 설정을 설정합니다.
- 세포에 확대, YFP의 사진 파괴는 세포 막에서 발생하고 프로그램을 시작할 수있는 투자 수익 (ROI)을 (관심 영역) 강조.
- 수용체의 사진 파괴 들면, 514 nm의 100 %에 AOTF를 조정하고 YFP 방출의 70 %가 소진되었습니다 때까지 계속 표백 레이저를 허용합니다. 표백 가속, 로아는 일반적으로 레이저의 래스터 축 (X 축)에 선정되었습니다.
- 사진 표백 동안, 이러한 측정치가 false로 효율성을 걱정 보고할 수 있듯이, 세포 운동을 모니터하고 XY - 비행기에서 감지할 수있을 정도의 운동과 함께 얻은 측정을 거부합니다.
- 사전 및 사후 표백 이미지는 기증자 (CFP)와 수용체 (YFP) 모두에 대한 기록과 효율성이로 계산됩니다 걱정입니다 모든 D 게시> D 미리 D 사전에 대한 EFF = (D 포스트 - D 미리) / D 게시물 걱정 그리고 D 게시하기 전에 각각 photobleaching 후 기증자의 강도입니다.
- JMP 소프트웨어 (SAS)는 실험 다양성의 범위를 결정하는 데 사용됩니다.
4. 대표 결과
Transfection 효율이 30-40% 사이에 일반적으로있다. 다른 이전의 연구 결과에도 불구하고, 우리는 한 벡터의 transfection과 표현이 다른의 좋아하는 것을 보지 못했어요. 사실, 우리는 자주 키메라 또는 다른 하나 형광단의 독점적인 표현을 관찰합니다. 일반은 효율이 수용체 시스템 간의 차이가 무서워. 타이 수용체 시스템, 전형적인 값은 상피 세포에 대한 20-28% 및 내피 세포에 19-23% 있습니다. 부정적인 컨트롤, 전형적인 효율은 다음과 2~3% 있습니다. 다양성의 정도는 경험이 상당히 줄어 듭니다.
그림 1. transfected EA.hy 926 세포의 대표적인 이미지. EA.hy 926 세포 monolayer의) DIC 이미지. (A)에 표시되는 세포의 B) 형광 이미지. 의 C) 중첩 (A)와 (B) 시연 ~ 20~30%의 transfection 효율.
그림 2. 대표 수용체는 EA.hy926 감방에서 CFP와 YFP 사이에 발생하는 걱정의 분석을 사진 표백. CFP 방출 채널 (상단 패널)와 YFP 방출 채널 (아래 두 패널)은 이전에 별도의 모니터링 및 게시물 수용체가 photobleaching되었습니다. Photobleaching 실험로 제한하고 녹색 상자 내의 지역에서 계산된 값을 무서워했다. 안달 효율은 오리 엔테이션을 위해 이미지를 통합 CFP / YFP의 확대 오버레이 부족 (자주색 - 0.0)로 높은 곳에서 절대 범위 (적색 - 1.0)로 표시됩니다.
Discussion
성공에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 그 중 가장 두드러진은 두 키메라 수용체 사이의 표현의 상대적인 수준입니다. 이 문제를 회피하기 위해 하나는 관심의 두 단백질을 표현하는 안정적인 세포 라인을 만들거나 이에 상응하는 표현을 허용하는 벡터 DNA의 최적 비율을 확인할 수 있습니다. 마찬가지로, 요리를 통해 비 균일한 transfection에 의한, 단백질 수준은 거의 세포 사이에 동등되지 않습니다. 따라서, 관심은 '낮음'에서 '높음'expressors를 구별할 지불하셔야합니다. 단백질의 표시 '평균'수준은 일반적으로 안정적이고 재현성 수확량 이들은 효율성을 무서워. 저희 연구소가이 문제를 해소하기 위해 추구가 하나의 방법은 '도'유전자 발현에 adeno 및 lenti - 바이러스를 사용하는 것입니다. 또한, 수용체 사진 표백 결정하는 다른 방법은 효율이 sensitized 방출됩니다 무서워. 실시간으로 단일 세포를 모니터링하는 sensitized 방출의 가능성에도 불구하고, 우리는 수용체 사진 표백 더 민감하고 더 신뢰할 수 발견,하지만.
마지막으로, 단백질 상호 작용을 모니터링하기 위해 안달 사용하여 도전해야하고, 멤브레인 바운드 수용체에 대한 링커 길이에주의 선택이 필요합니다. 또한, C / YFP의 추가는 종종 크게 endoplasmic reticulum과 잠돌군 Zz 장치의 집합의 단백질 발현 수준과 결과에 영향을 미칩니다. 그러나, 과도, 또는 불안 정한 상호 작용에 대한, 초조가 활용할 수있는 이상적인 방법입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 공촛점 현미경과 관련하여 도움이 박사 스콧 헨더슨을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 WAB 현미경으로 의학의 매시 암 센터 및 학교 (VCU) VCU - 도서관에서 공연되었다에서 WAB로 건강 1RO1CA127501 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라 파일럿 프로젝트 기금에 의해 지원되었다. 의 신경 생물학 및 NIHNINDS 센터 핵심 부여 5P30NS047463에서 자금 일부 지원 해부 현미경 시설,,,.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
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