Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.
Abstract
Eiwit-eiwit interacties zijn een kenmerk van alle essentiële cellulaire processen. Echter, veel van deze interacties zijn van voorbijgaande aard, of energetisch zwak, het voorkomen van het identificatie en analyse door middel van traditionele biochemische methoden, zoals co-immunoprecipitatie. In dit verband hebben de genetisch encodable fluorescerende eiwitten (GFP, RFP, enz.) en de bijbehorende overlappende fluorescentiespectrum een revolutie in ons vermogen om zwakke interacties in vivo met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) 1-3 monitor. Hier hebben we detail ons gebruik van een FRET-gebaseerde nabijheid test voor het toezicht op receptor-receptor interacties op de endotheliale celoppervlak.
Protocol
Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen. De eerste, stap het klonen van je gen van belang in een zoogdier expressievector amino-terminaal aan de monomere versies van het GVB en / of YFP zal slechts kort worden besproken. De tweede en derde stap, transfectie van vector-DNA in EA.hy926 endotheelcellen, en confocale beeldvorming met FRET, staan beschreven in meer diepte beneden.
1. Bouw van CFP en YFP chimère receptoren
Receptoren van de rente moeten amino-terminaal worden gekloond om monomere verbeterde versies van het GVB en YFP. Bepaling van het FRET is empirisch en is sterk afhankelijk van de lengte van tussen de linker transmembraan spanning regio en begin van de fluorofoor 1. Daarom moet een aantal verschillende lengten van de linker worden onderzocht voor elke nieuwe receptor paar in onderzoek.
- In de pcDNA3.1 hygro R-of neo R vector die monomere C-of YFP (deze vector kunnen worden verkregen bij ons lab), kloon je receptor van belang in de Nhel / EcoRI plaatsen. * NB-Indien nodig, Nhel is compatibel diverse andere enzymen waaronder Spel en Xbal.
- Transformeer uw ligatiereactie in een geschikte endA1 recA bevoegde cellijn (we routinematig gebruik van mach1). Scherm kolonies op de aanwezigheid van insert, gevolgd door DNA-sequencing om de afwezigheid van mutaties te controleren.
- Na het verkrijgen van conformatie van een succesvolle moleculair klonen, voorbereiden transfectie-grade vector-DNA in gesteriliseerd water of TE behulp van Qiagen, of iets dergelijks, DNA-kits. Evalueer de concentratie en zuiverheid met behulp van UV-spectroscopie. Typische rendementen van DNA moet worden in het bereik van 100-200 ug, die routinematig wordt verdund tot een werkvoorraad van 1 ug / ul.
2. Transfectie van EA.hy 926 cellen
- Split EA.hy 926 cellen 4, gekweekt in volledige-DMEM (DMEM + 10% foetaal runderserum + Pen. / Strep.) In MatTek dekglaasje (nr. 0) 35 mm gerechten met 2 ml medium. U kunt conservatief verkrijgen ~ 15 gerechten (~ 90% confluent de volgende dag) van een 15 cm samenvloeiend schotel. Bereid een schotel om de expressie van ieder individu receptor, maar ook een schotel voor elke receptor paar te evalueren.
- Laat de cellen een nacht incuberen in 5% CO 2 atmosfeer bij 37 ° C. De volgende dag, moeten de culturen ~ 70-90% confluent.
- Op de dag van de transfectie, bereiden de nucleolipid complexen door het mengen van 2 ug van het chimère receptor vector DNA (2 pi) met 8 pi van Fugene6 in 200 pi van de voorverwarmde OptiMEM. Voor de receptor paren, transfecteren met 1 ug van elke receptor, voor een totaal van 2 ug (zie ook bespreking hieronder).
- Meng voorzichtig door de inversie.
- Blijf op kamertemperatuur incuberen gedurende 30 minuten.
- Tijdens de incubatietijd, de voorbereiding van de cellen voor transfectie. Aspireren uit vers medium en was elk bord voorzichtig en kort met warm PBS vóór de toevoeging van 2 ml voorverwarmde compleet-DMEM zonder antibiotica (DMEM + FBS). Het is belangrijk om te voorkomen dat de aanwezigheid van penicilline en streptomycine, omdat ze aanzienlijk meer giftig voor cellen tijdens de behandeling met Fugene6.
- Voeg de complexe druppelsgewijs naar de cellen en incubeer gedurende een extra 20-24 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 atmosfeer.
- Na 24 uur, voorzichtig zuigen de media uit de cellen en pipet verse compleet-DMEM met antibiotica. Na transfectie, levensvatbaarheid van de cellen moeten blijven relatief hoog, dat wil zeggen weinig tot geen drijvende cellen moeten in acht worden genomen.
- Genexpressie is meestal maximaal na een extra 48 tot 60 uur na transfectie. Maar beeldvorming is meestal haalbaar zo kort als 24 uur. Tijdsverloop experimenten voor een optimale genexpressie moet worden uitgevoerd.
3. Confocale Imaging en FRET-analyse
Live-cell imaging wordt uitgevoerd op een Leica TCS-SP2 AOBS confocale laser scanning microscoop uitgerust met blauwe diode (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm). groene HeNe (543 nm), oranje HeNe (594 nm), en rood HeNe (633 nm) lasers, een HCX PI Apo 63x/1.3 na glycerine-immersie objectief, een gemotoriseerde XY fase (Märzhäuser), en een milieuvriendelijke gecontroleerd ( temperatuur, vochtigheid en CO 2) stadium incubator (Pecon). Experimentele controles zijn essentieel voor fluorofoor overspraak tussen de emissie-kanalen en te evalueren uitdrukking kwesties en niet-specifieke fluorofoor multimerization te elimineren. Als zodanig zijn enkele fluorofoor transfecties gebruikt voor het opzetten van elk beeld sessie. Negatieve FRET controles (met gebruikmaking van bekende noninteracting receptoren) zullen moeten worden uitgevoerd, om de achtergrond te bepalen FRET die optreedt als gevolg van te expressie.
- Te elimineren overspraak tussen de emissie-kanalen voor CFP en YFP, plaats van het GVB uitdrukking controle naar het podium incubator. Met behulp van wit licht, stel de Z-plaat te richten opnaar de cellen.
- Set SP-venster de instellingen voor emissie detectie van het GVB om 465 tot 505 nm en YFP tot 525-600 nm.
- Terwijl het toezicht zowel emissie-kanalen, prikkelen het GVB bij 458 nm. Met behulp van de AOTF, stelt u het laservermogen tot aanzienlijke bloeden te elimineren dan van het GVB in de YFP emissie-kanaal. Bewaar deze instelling.
- Voer dezelfde controle voor YFP overspraak (met de YFP expressie controle) in de GVB-kanaal door het aanpassen van de excitatie vermogen bij 514 nm voor de cellen die alleen YFP. Bewaar deze instelling.
- Volgende plaats cellen die co-expressie CFP en YFP naar het podium incubator. Met behulp van de volgorde instelling voor de Leica confocale software, zoek cellen die een vergelijkbaar niveau van CFP en YFP met de juiste membraan lokalisatie.
- Met behulp van de Leica software acceptor foto bleken programma, de donor en acceptor instellingen op uw opgeslagen CFP en YFP-instellingen, respectably.
- Zoomen op de cel, markeert een ROI (gebied van belang) waarin de foto-vernietiging van YFP is voor te komen op de celmembraan en het programma te beginnen.
- Voor de foto-vernietiging van de acceptor, pas de AOTF tot 100% bij 514 nm en laat de laser bleken om door te gaan tot de 70% van de emissie YFP is uitgeput. Te versnellen bleken, zijn ROI meestal gekozen in het raster as van de laser (X-as).
- Tijdens de foto-bleken, toezicht op de cellulaire beweging en verwerpen metingen verkregen met aanzienlijke beweging in het XY-vlak, omdat deze metingen kunnen melden valse FRET efficiëntie.
- Pre-en post-bleekmiddelen beelden worden opgenomen voor zowel de donor (GVB) en de acceptor (YFP) en FRET efficiëntie wordt berekend als: FRET Eff = (D post-D pre) / D post voor alle D bericht> D pre waarbij D pre en D na is de donor intensiteit voor en na fotobleken respectievelijk.
- JMP Software (SAS) wordt gebruikt om de omvang van de experimentele variabiliteit te bepalen.
4. Representatieve resultaten
Transfectie efficiëntie zijn meestal tussen de 30 tot 40%. Ondanks de eerdere bevindingen door anderen, hebben we niet gezien dat transfectie en expressie van een vector die van de andere gunsten. Sterker nog, we vaak waarnemen exclusieve uitdrukking van een fluorofoor hersenschim of het ander. Typische FRET efficiëntie variëren tussen receptor systemen. Voor de Tie-receptor-systeem, typische waarden zijn 20-28% van epitheliale cellen en 19-23% in endotheelcellen. Voor de negatieve controles, typische efficiëntie worden hieronder 2-3%. De mate van variabiliteit aanzienlijk zullen dalen met ervaring.
Figuur 1. Representatief beeld van de getransfecteerde EA.hy 926 cellen. A) DIC beeld van EA.hy 926 cel monolaag. B) Fluorescentie beeld van de cellen wordt weergegeven in (A). C) Overlay van (A) en (B) aan te tonen ~ 20-30% transfectie-efficiëntie.
Figuur 2. Representatieve acceptor foto-bleken analyse van FRET zich tussen het GVB en YFP in een EA.hy926 cel. Het GVB emissie kanaal (boven panelen) en YFP emissie-kanaal (twee onderste panelen) werden afzonderlijk gevolgd voor en na de acceptor fotobleking. Fotobleken experimenten werden beperkt tot, en FRET waarden berekend uit de regio in de groene doos. FRET efficiëntie wordt weergegeven als een absolute variëren van hoog (rood-1.0) tot laag (paars-0.0) op een vergrote overlay van een GVB / YFP samengevoegde afbeelding voor oriëntatie doeleinden.
Discussion
Er zijn verschillende stappen die essentieel zijn voor succes. De meest prominente onder hen is de relatieve niveaus van expressie tussen de twee chimère receptoren. Om dit probleem te omzeilen, kan een te maken stabiele cellijnen te drukken beide eiwitten van belang, of te identificeren optimale ratio's van vector DNA gelijkwaardige expressie mogelijk te maken. Op dezelfde manier, als gevolg van niet-uniforme transfectie in een schotel, zal eiwitniveaus zelden gelijkwaardig tussen cellen. Daarom moet aandacht worden besteed aan 'hoog' expressors te onderscheiden van 'laag'. Degenen die display 'gemiddelde' niveaus van eiwit levert doorgaans betrouwbare en reproduceerbare FRET efficiëntie. Een methode ons lab heeft gevoerd om dit probleem te verlichten is het gebruik van adeno-en Lenti-virussen 'zelfs' genexpressie. Bovendien, een alternatieve methode om acceptor foto-bleken voor het bepalen van FRET efficiëntie is gesensibiliseerd emissie. Hoewel, ondanks het potentieel van gevoelig emissie naar individuele cellen in real-time monitor, hebben we gevonden acceptor foto-bleken te zijn gevoeliger en betrouwbaarder.
Tot slot kan met behulp van FRET aan eiwit interacties te controleren uitdagend zijn, en vereist een zorgvuldige selectie van de linker lengtes voor membraan-gebonden receptoren. Bovendien is de toevoeging van C / YFP vaak grote invloed op eiwit expressie niveau en resulteert in aggregatie in het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat. Echter, voor voorbijgaande aard, of instabiel, interacties, FRET is de ideale methode om te gebruiken.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij willen Dr Scott Henderson erkennen voor hulp bij confocale microscopie. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health 1RO1CA127501 om WAB als proefproject financiering van de Massey Cancer Center en de School of Medicine (VCU) om WAB Microscopie werd uitgevoerd bij de VCU-Dept. voor Neurobiologie en Anatomie Microscopy Facility, ondersteund, voor een deel, met geld van NIHNINDS Center kern te verlenen 5P30NS047463.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).
