Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild-Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines FRET-basierten Proximity Assay.
Abstract
Protein-Protein-Interaktionen sind ein Markenzeichen aller wesentlichen zellulären Prozessen. Allerdings sind viele dieser Wechselwirkungen transiente oder energetisch schwach, die Verhinderung ihrer Identifizierung und Analyse durch traditionelle biochemische Methoden wie Co-Immunopräzipitation. In dieser Hinsicht haben die genetisch kodierbaren fluoreszierende Proteine (GFP, RFP, etc.) und die damit verbundenen überlappenden Fluoreszenzspektrum revolutioniert unsere Fähigkeit, schwache Wechselwirkungen in vivo mit Förster resonance energy transfer (FRET) 1-3 überwachen. Hier Detail haben wir den Einsatz eines FRET-basierten Proximity Assay zur Überwachung Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen auf der endothelialen Zelloberfläche.
Protocol
Das Protokoll besteht aus drei Schritten. Der erste Schritt für das Klonen von Ihrem Gen von Interesse in einen Säugerexpressionsvektor Amino-terminal an die monomeren Versionen von GFP und / oder YFP wird nur kurz besprochen werden. Die zweite und dritte Schritt, die Transfektion von Vektor-DNA in EA.hy926 Endothelzellen und konfokale Bildgebung mit FRET, sind in mehr Tiefe im Folgenden erläutert.
1. Bau von CFP und YFP chimäre Rezeptoren
Rezeptoren von Interesse sollte Amino-terminal an monomeren erweiterte Versionen von CFP und YFP geklont werden. Bestimmung von FRET ist empirisch und hängt entscheidend von der Länge des Linkers zwischen den Transmembran Spanning Region und zu Beginn des Fluorophors 1. Deshalb müssen verschiedene Längen von Linker für jeden neuen Rezeptor-Paar zu untersuchenden erkundet werden.
- In den pcDNA3.1 Hygro R oder neo R-Vektor, der monomeren C-oder YFP (dieses Vektors können aus unserem Labor angefordert werden), Klon Ihrer Rezeptor von Interesse in die NheI / EcoRI. * Hinweis: Wenn nötig, wird NheI kompatibel mehrere andere Enzyme, einschließlich SpeI und XbaI.
- Verwandeln Sie Ihren Ligationsreaktion in eine geeignete endA1 recA zuständige Zelllinie (verwenden wir routinemäßig Mach1). Screen-Kolonien auf die Anwesenheit des Einsatzes gefolgt von DNA-Sequenzierung, um die Abwesenheit von Mutationen zu überprüfen.
- Nach Erhalt Konformation des erfolgreichen molekularen Klonen vorbereiten Transfektion-grade Vektor-DNA in sterilem Wasser oder TE mit Qiagen, oder ähnliche, DNA-Kits. Bewerten Konzentration und Reinheit mittels UV-Spektroskopie. Typische Ausbeuten von DNA sollte im Bereich von 100-200 pg, die routinemäßig an eine funktionierende Bestand von 1 ug / ul verdünnt werden.
2. Die Transfektion von EA.hy 926 Cells
- Split EA.hy 926 Zellen 4, in Komplett-DMEM (DMEM +10% Fötales Rinderserum + Pen. / Strep.) In MatTek Deckglas (Nr. 0) 35 mm Gerichte mit 2 mL Medium. Sie können konservativ zu erhalten ~ 15 Gerichte (~ 90% konfluent am folgenden Tag) aus einer 15 cm konfluenten Schale. Bereiten Sie ein Gericht um die Expression von einzelnen Rezeptor, sowie ein Gericht für jeden Rezeptor-Paar zu bewerten.
- Lassen Sie die Zellen zu inkubieren in 5% CO 2-Atmosphäre über Nacht bei 37 ° C. Am nächsten Tag sollte der Kulturen ~ 70-90% konfluent sein.
- Am Tag der Transfektion, bereiten die Nukleolipid Komplexe durch Mischen von 2 ug des chimären Rezeptors Vektor-DNA (2 mL) mit 8 ul Fugene6 in 200 ul vorgewärmtes OptiMEM. Für Rezeptor-Paare, transfizieren mit 1 ug jeder Rezeptor, für eine Gesamtmenge von 2 pg (Siehe auch die Diskussion unten).
- Vorsichtig mischen durch Umdrehen.
- Weiter bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren.
- Während der Inkubationszeit, bereiten die Zellen für die Transfektion. Absaugen frischen Medien und waschen jede Platte vorsichtig und kurz mit warmem PBS vor der Zugabe von 2 mL vorgewärmten complete-DMEM ohne Antibiotika (DMEM + FBS). Es ist wichtig, um die Anwesenheit von Penicillin und Streptomycin zu vermeiden, da sie wesentlich mehr Zellen toxisch sind während der Behandlung mit Fugene6.
- Fügen Sie die komplexen tropfenweise zu den Zellen und inkubieren für eine weitere 20-24 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Atmosphäre.
- Nach 24 Stunden sorgfältig absaugen die Medien aus den Zellen und Pipette frisches vollständiges-DMEM mit Antibiotika. Nach der Transfektion die Lebensfähigkeit der Zellen sollte relativ hoch bleiben, also wenig bis gar keine schwimmenden Zellen beobachtet werden sollte.
- Die Genexpression wird in der Regel maximal nach einer weiteren 48-60 Stunden nach der Transfektion. Allerdings ist Bildgebung in der Regel möglich, in so kurz wie 24 Stunden. Zeitlicher Verlauf Experimente für eine optimale Genexpression durchgeführt werden soll.
3. Konfokale Bildgebung und FRET-Analyse
Live Cell Imaging ist auf einem Leica TCS-SP2 AOBS konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit blauen Diode (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm) ausgestattet war. grünen HeNe (543 nm), orange HeNe (594 nm) und roten HeNe (633 nm)-Laser, ein HCX PI Apo 63x/1.3 na Glycerin-Immersions-Objektiv, einem motorisierten XY-Tisch (Märzhäuser) und einem kontrollierten Umweltbedingungen ( Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2) Bühne Inkubator (Pecon). Experimentelle Kontrollen sind wichtig, um Fluorophor cross-talk zwischen der Emission Kanäle sowie Ausdruck auswerten Fragen und unspezifische Fluorophor Multimerisierung beseitigen. Als solche sind einzelne Fluorophor Transfektionen für die Einrichtung jedes Bild Session genutzt. Negative FRET Kontrollen (unter Verwendung von bekannten wechselwirkenden Rezeptoren) müssen durchgeführt werden, um dadurch den Hintergrund herauszurechnen FRET, das auftritt, durch Überexpression.
- Zur Vermeidung von Übersprechen zwischen den Emissions-Kanäle für CFP und YFP, Ort der GFP Expression Kontrolle in die Stufe Inkubator. Mit weißem Licht, stellen Sie die Z-Platte zu konzentrierenzu den Zellen.
- Set SP-Fenster Einstellungen für Emissions-Detektion von GFP 465-505 nm und YFP zu 525-600 nm.
- Während die Überwachung sowohl Emissions-Kanäle, erregen die GFP bei 458 nm. Mit dem AOTF, setzen Sie die Laserleistung auf nennenswerte Blutung über der GFP zu beseitigen in der YFP-Emission-Kanal. Speichern Sie diese Einstellung.
- Führen Sie die gleiche Steuerung für YFP Übersprechen (mit dem YFP Ausdruck control) in der GFP-Kanal durch die Anpassung der Erregung Leistung bei 514 nm für die Zellen, die nur YFP. Speichern Sie diese Einstellung.
- Nächster Ort Zellen co-exprimierenden CFP und YFP in das Stadium Inkubator. Anhand der Sequenzdaten Einstellung für die Leica konfokalen Software, suchen Sie exprimieren ähnliches Niveau von CFP und YFP mit der richtigen Membran Lokalisierung.
- Mit der Leica Software Akzeptor Photobleaching Programm, stellen Sie den Donor-und Akzeptor-Einstellungen, um Ihre gespeicherten CFP und YFP-Einstellungen, anständig.
- Zoomen auf die Zelle, markieren Sie den ROI (Region of Interest), in dem das Foto-Zerstörung von YFP ist auf der Zellmembran auftreten und beginnen das Programm.
- Für Foto-Zerstörung des Akzeptors, passen Sie die AOTF zu 100% bei 514 nm und damit der Laser-Bleaching, weiterhin bis zu 70% der YFP-Emission erschöpft ist. Zur Beschleunigung Bleichen, sind ROIs in der Regel im Raster-Achse des Lasers (X-Achse) gewählt.
- Während Foto-Bleichen, überwachen die zelluläre Bewegung und lehnen Messungen mit nennenswerten Bewegung in der XY-Ebene erhalten, da diese Messungen können Bericht falsch FRET Effizienz.
- Pre-und Post-Bleiche Bilder sind für beide Donor (CFP) und Akzeptor (YFP) erfasst und FRET-Effizienz wie folgt berechnet: FRET Eff = (D post-D pre) / D Beitrag für alle D Beitrag> D vor dem D vor und D Beitrag ist der Spender Intensität vor und nach dem Ausbleichen bzw..
- JMP Software (SAS) wird verwendet, um das Ausmaß der experimentellen Variabilität zu bestimmen.
4. Repräsentative Ergebnisse
Transfektionseffektivitäten sind in der Regel zwischen 30 bis 40%. Trotz früherer Befunde von anderen, haben wir nicht gesehen, dass die Transfektion und Expression von einem Vektor, der anderen begünstigt. In der Tat, wir häufig beobachten, exklusive Expression von einem Fluorophor Chimäre oder das andere. Typische FRET Effizienzen variieren zwischen Rezeptor-Systeme. Für den Tie-Rezeptor-System, sind typische Werte 20-28% für Epithelzellen und 19-23% in Endothelzellen. Für negative Kontrollen sind typische Wirkungsgrade unter 2-3%. Das Ausmaß der Variabilität wird deutlich sinken mit Erfahrung.
Abbildung 1. Repräsentative Bilder von transfizierten EA.hy 926 Zellen. A) DIC Bild EA.hy 926 Zellmonolayer. B) Fluoreszenzbild von Zellen in (A) angezeigt. C) Überlagerung von (A) und (B) demonstriert ~ 20-30% Transfektionseffizienz.
Abbildung 2. Vertreter Akzeptor Photobleaching Analyse von FRET zwischen CFP und YFP vorkommenden in einer EA.hy926 Zelle. Die GFP-Emission-Kanal (obere Bilder) und YFP-Emission-Kanal (unten zwei Tafeln) wurden separat vor überwacht und post-Akzeptor Bleichen. Photobleaching Experimente wurden eingeschränkt, und FRET-Werte aus, die Region in der grünen Box berechnet. FRET-Effizienz wird als absolute reichen von hoch (rot-1.0) zu niedrig ist (lila-0.0) auf einem vergrößerten Überlagerung eines CFP / YFP angezeigt zusammengefügte Bild nur zur Orientierung.
Discussion
Es gibt mehrere Schritte, die für den Erfolg entscheidend sind. Der prominenteste unter ihnen ist die relative Bedeutung der Ausdruck zwischen den beiden chimären Rezeptoren. Zur Umgehung dieses Problems, kann man machen, stabilen Zelllinien, sowohl Proteine von Interesse, oder ermitteln die optimale Verhältnis von Vektor-DNA zu gleichwertigen Ausdruck zu ermöglichen. Auch aufgrund der uneinheitlichen Transfektion in eine Schüssel, werden Protein-Ebene nur selten gleichwertig zwischen den Zellen. Deshalb ist darauf zu achten, um "high" Expressoren von «niedrig» zu unterscheiden. Diejenigen, die Anzeige "durchschnittlichen" Mengen an Protein in der Regel liefern zuverlässige und reproduzierbare FRET Effizienz. Eine Methode, unser Labor verfolgt, um dieses Problem zu lindern, ist die Verwendung von Adeno-und Lenti-Viren ", auch" Gen-Expression. Darüber hinaus FRET eine alternative Methode zur Akzeptor Photobleaching zur Bestimmung Effizienz ist sensibilisierte Emission. Obwohl trotz des Potenzials der sensibilisierte Emission auf einzelne Zellen in Echtzeit zu überwachen, haben wir Akzeptor Photobleaching empfindlicher und zuverlässiger gefunden.
Schließlich kann mittels FRET zu Protein-Wechselwirkungen Monitor eine Herausforderung sein, und erfordert eine sorgfältige Auswahl der Linker Längen für membrangebundene Rezeptoren. Darüber hinaus Zugabe von C / YFP oft einen großen Einfluss auf die Proteinexpression Ebenen und die Ergebnisse in die Aggregation im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat. Doch für transiente oder instabil, Interaktionen, ist FRET die ideale Methode zu nutzen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir wünschen Herrn Dr. Scott Henderson für die Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie zu bestätigen. Diese Forschung wurde durch Bewilligungen von den National Institutes of Health 1RO1CA127501 zu WAB sowie Pilotprojekt Mittel aus dem Massey Cancer Center and School of Medicine (VCU), um WAB-Mikroskopie wurde an der VCU-Abteilung durchgeführt unterstützt. für Neurobiologie und Anatomie Microscopy Facility, unterstützt, zum Teil mit Mitteln aus NIHNINDS Zentrum Kern gewähren 5P30NS047463.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
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- Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).
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