Summary
Ce protocole décrit comment l'image interactions protéine-protéine en utilisant un dosage de proximité basée sur le FRET.
Abstract
Interactions protéine-protéine sont une caractéristique de tous les processus essentiels cellulaire. Cependant, beaucoup de ces interactions sont transitoires ou énergétiquement faibles, ce qui empêche leur identification et leur analyse par des méthodes traditionnelles biochimiques tels que la co-immunoprécipitation. À cet égard, les protéines génétiquement codable fluorescente (GFP, RFP, etc) et leurs associés se chevauchent spectre de fluorescence ont révolutionné notre capacité à surveiller les interactions faibles in vivo en utilisant le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) 1-3. Ici, nous détaillons notre utilisation d'un dosage de la proximité FRET pour la surveillance des interactions récepteur-récepteur à la surface des cellules endothéliales.
Protocol
Le protocole comprend trois étapes principales. La première, le clonage étape de votre gène d'intérêt dans un vecteur d'expression mammifère aminés terminale aux versions monomères de PCP et / ou YFP ne sera discuté brièvement. Les deuxième et troisième étapes; transfection d'ADN vecteur dans EA.hy926 cellules endothéliales, et l'imagerie confocale avec FRET, sont décrits plus en détail ci-dessous.
1. La construction de récepteurs chimériques CFP et YFP
Récepteurs d'intérêt devrait être cloné aminés terminale à monomérique des versions améliorées de CFP et YFP. Détermination de FRET est empirique et dépend essentiellement de la longueur de liaison entre le transmembranaire couvrant la région et le début du fluorophore 1. Par conséquent, différentes longueurs de linker doivent être explorées pour chaque paire de récepteurs de nouveau sous enquête.
- Dans le R pcDNA3.1 hygro ou néo R vecteur contenant monomère C ou YFP (ce vecteur peut être obtenu à partir de notre laboratoire), clone de votre récepteur d'intérêt dans les sites Nhel / EcoRI. * Remarque: si nécessaire, Nhel est compatible plusieurs autres enzymes, y compris Spel et Xbal.
- Transformez votre réaction de ligature dans une ligne appropriée endA1 recA cellule compétente (Nous utilisons régulièrement Mach1). Colonies d'écran pour la présence de l'insert suivi par séquençage de l'ADN pour vérifier l'absence de mutations.
- Dès l'obtention de conformation de clonage moléculaire de succès, de préparer l'ADN du vecteur de transfection de qualité dans de l'eau stérilisée ou TE utilisant Qiagen, ou similaire kits ADN,. Évaluer la concentration et la pureté en utilisant la spectroscopie UV. Les rendements typiques de l'ADN devrait être de l'ordre de 100-200 mg, qui est habituellement diluée à un stock de travail de 1 ug / uL.
2. La transfection de cellules 926 EA.hy
- Fractionner EA.hy 926 cellules 4, cultivé en complète-DMEM (DMEM 10% sérum de veau fœtal + pen. / Strep.) Dans MatTek lamelle (n ° 0) 35 plats mm avec 2 ml de milieu. Vous pouvez obtenir des conservatrice ~ 15 plats (~ 90% de confluence le jour suivant) d'un plat de 15 cm confluentes. Préparer un plat pour évaluer l'expression de chacun des récepteurs individuels, ainsi que d'un plat pour chaque paire de récepteur.
- Laisser les cellules à incuber pendant la nuit dans atmosphère de CO 2 de 5% à 37 ° C. Le jour suivant, les cultures doivent être confluentes ~ 70-90%.
- Le jour de la transfection, de préparer les complexes nucléolipidiques en mélangeant 2 ug de l'ADN du vecteur récepteur chimérique (2 ul) avec 8 uL d'FuGENE6 dans 200 ul de pré-chauffé OptiMEM. Pour les couples récepteur, transfecter avec 1 pg de chaque récepteur, pour un total de 2 pg (Voir aussi la discussion ci-dessous).
- Mélanger doucement par inversion.
- Continuer à incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
- Pendant la période d'incubation, préparer les cellules pour la transfection. Aspirer des milieux frais et laver chaque assiette doucement et brièvement avec du PBS tiède avant l'ajout de 2 mL préchauffé complète-DMEM sans antibiotiques (DMEM + FBS). Il est important d'éviter la présence de pénicilline et de streptomycine, car ils sont beaucoup plus toxiques pour les cellules pendant le traitement avec FuGENE6.
- Ajouter la baisse complexes sage de cellules et incuber pendant une heure supplémentaire de 20 à 24 à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5%.
- Après 24 heures, aspirer délicatement les médias à partir des cellules et la pipette fraîche complète-DMEM avec des antibiotiques. Après transfection, la viabilité cellulaire devrait rester relativement élevé, c'est à dire peu ou pas de cellules flottantes doivent être observées.
- L'expression des gènes est généralement maximale après une heure supplémentaire de 48 à 60 après la transfection. Cependant, l'imagerie est généralement possible dans le plus court de 24 heures. Expériences bien sûr du temps pour l'expression des gènes optimale doit être effectuée.
3. Imagerie confocale et analyse FRET
Imagerie des cellules vivantes est effectuée sur un Leica TCS-SP2 microscope confocal à balayage laser AOBS équipé de diodes bleues (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm). verte HeNe (543 nm), orange HeNe (594 nm) et rouge HeNe (633 nm) des lasers, une HCX PI Apo 63x/1.3 lentilles na objectif de glycérine immersion, un motorisé XY (Märzhäuser), et un environnement contrôlé ( température, l'humidité et le CO 2) stade de l'incubateur (PeCon). Contrôles expérimentaux sont essentielles pour éliminer fluorophore diaphonie entre les canaux d'émission ainsi que d'évaluer les problèmes d'expression et de multimérisation fluorophore non spécifiques. En tant que tel, transfections fluorophore unique sont utilisés pour la mise en place chaque session de l'image. Negative FRET contrôles (en utilisant des récepteurs connus non interagissant) devront être effectués, afin de déterminer l'arrière-plan FRET qui se produit en raison de l'expression plus.
- Pour éliminer la diaphonie entre les canaux d'émission pour les CFP et YFP, placer le contrôle d'expression de la PCP dans l'incubateur scène. Utilisation de la lumière blanche, ajuster le Z-plaque pour se concentrer surpour les cellules.
- Réglez les paramètres de fenêtre SP pour la détection des émissions de PCP à 465-505 nm et 525-600 nm pour la YFP.
- Bien que la surveillance des deux canaux d'émission, excitent la PCP à 458 nm. Utilisation de la AOTF, réglez la puissance du laser pour éliminer saignent plus appréciables de la PCP dans le canal d'émission YFP. Enregistrer ce paramètre.
- Effectuer le même contrôle pour YFP diaphonie (en utilisant le contrôle d'expression YFP) dans le canal PCP en ajustant la puissance d'excitation à 514 nm pour les cellules exprimant la YFP seulement. Enregistrer ce paramètre.
- Cellules de lieu Suivant co-exprimant CFP et YFP dans l'incubateur scène. Utilisation de la mise en séquence pour le logiciel Leica confocale, de localiser les cellules exprimant des niveaux similaires de CFP et YFP avec localisation membrane propre.
- En utilisant l'accepteur logiciel Leica photo-décoloration programme, définir les paramètres de donneur et accepteur de votre PCP sauvé et les paramètres de la YFP, respectable.
- Zoom sur la cellule, sélectionnez un ROI (région d'intérêt) dans lequel la photo-destruction de la YFP est de se produire sur la membrane cellulaire et de commencer le programme.
- Pour la photo-destruction de l'accepteur, ajuster la AOTF à 100% à 514 nm et de permettre au laser de blanchiment de continuer jusqu'à 70% de l'émission YFP a été épuisé. Pour accélérer le blanchiment, ROIs sont généralement choisis dans l'axe trame du laser (axe X).
- Lors de photo-blanchiment, de surveiller le mouvement cellulaire et de rejeter les mesures obtenues avec le mouvement appréciable dans le plan XY, que ces mesures peuvent faux rapport FRET efficacité.
- Des images pré-et post-blanchiment sont enregistrées à la fois pour les donateurs (PCP) et accepteur (YFP) et l'efficacité de FRET est calculé comme suit: FRET Eff = (D après-D pré) / D post pour tous les poste D> D où D pré pré et D est l'intensité après donneur avant et après photoblanchiment respectivement.
- JMP Software (SAS) est utilisé pour déterminer l'étendue de la variabilité expérimentale.
4. Les résultats représentatifs
Efficacités de transfection sont généralement entre 30 à 40%. Malgré les conclusions précédentes par d'autres, nous n'avons pas vu que la transfection et l'expression d'un vecteur favorise celle de l'autre. En effet, nous observons fréquemment l'expression exclusive d'un fluorophore chimère ou de l'autre. Typiques FRET efficacités varient entre les systèmes récepteurs. Pour que le système récepteur Tie, les valeurs typiques sont 20-28% pour les cellules épithéliales et 19-23% dans les cellules endothéliales. Pour les contrôles négatifs, les rendements typiques sont inférieurs à 2-3%. L'étendue de la variabilité diminue considérablement avec l'expérience.
Figure 1. Des images représentatives de transfectées EA.hy 926 cellules. Une image) DIC de monocouche cellulaire EA.hy 926. B) image de fluorescence des cellules affichées dans (A). C) Superposition de (A) et (B) ~ démontrant l'efficacité de transfection de 20-30%.
Figure 2. Accepteur Représentant photo-décoloration analyse de FRET survenant entre CFP et YFP dans une cellule EA.hy926. La PCP émission de canal (haut) et d'émission de canal YFP (en bas deux panneaux) ont été évalués séparément, avant et après l'accepteur photoblanchiment. Expériences de photoblanchiment ont été limités à, et FRET valeurs calculées à partir, dans la région au sein de la boîte verte. FRET efficacité est affichée comme une plage absolue de haute (rouge-1.0) à faible (violet-0.0) sur une superposition agrandie d'une CFP / YFP a fusionné l'image à des fins d'orientation uniquement.
Discussion
Il ya plusieurs étapes qui sont essentiels à la réussite. Les plus éminents d'entre eux est le niveau relatif d'expression entre les deux récepteurs chimériques. Pour contourner ce problème, on peut faire des lignées cellulaires stables exprimant à la fois des protéines d'intérêt, ou d'identifier des ratios optimaux de l'ADN de vecteur pour permettre l'expression équivalente. De même, pour cause de non-uniforme de transfection dans un plat, les taux de protéines seront rarement équivalentes entre les cellules. Par conséquent, il faut faire attention de distinguer «élevé» expresseurs de «faible». Ceux que les niveaux «moyen» d'affichage de protéines généralement le rendement fiables et reproductibles FRET efficacité. Une méthode de notre laboratoire a poursuivi pour soulager ce problème est l'utilisation des adénovirus et des virus à lenti-expression du gène 'pair'. Par ailleurs, une méthode alternative à la photo-blanchiment d'accepteur pour déterminer l'efficacité de FRET est l'émission sensibilisés. Bien que, malgré le potentiel d'émission sensibilisés à surveiller les cellules individuelles en temps réel, nous avons trouvé de photo-blanchiment d'accepteur d'être plus sensible et plus fiable.
Enfin, en utilisant le FRET pour surveiller les interactions entre protéines peut être difficile, et nécessite une sélection rigoureuse des longueurs de liaison pour les récepteurs membranaires liées. Par ailleurs, l'ajout de C / YFP souvent une grande influence sur les niveaux d'expression des protéines et des résultats de l'agrégation dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi. Toutefois, pour des interactions transitoires, ou instable, FRET est la méthode idéale à utiliser.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Scott Henderson pour aider à la microscopie confocale. Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health 1RO1CA127501 à WAB ainsi que le financement du projet pilote du Centre du cancer Massey et Ecole de Médecine (ECV) à la microscopie WAB a été réalisée à l'ECV-Dept. de neurobiologie et de microscopie anatomie, pris en charge, en partie, grâce au financement du Centre NIHNINDS coeur 5P30NS047463 subvention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).
