Summary
Этот протокол описывает, как изображение белок-белковых взаимодействий с использованием FRET основе близости анализа.
Abstract
Белок-белковые взаимодействия являются отличительной чертой всех важных клеточных процессов. Однако многие из этих взаимодействий являются преходящими, или энергетически слабые, предотвращая их выявление и анализ с помощью традиционных биохимических методов, таких как со-иммунопреципитации. В этой связи, генетически кодируемую флуоресцентных белков (GFP, ППП и т.п.) и связанные с ними перекрытия спектра флуоресценции революцию наша способность контролировать слабых взаимодействий в естественных условиях использования Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) 1-3. Здесь мы подробно наше использование FRET основе близости тест для мониторинга рецептор-рецептор взаимодействий на поверхности клеток эндотелия.
Protocol
Протокол состоит из трех основных этапов. Во-первых, шаг клонирования ваших интересующего гена в вектор экспрессии млекопитающих амино-неизлечимо к мономерной версий CFP и / или YFP будет обсуждаться только кратко. Второй и третий шаги; трансфекции ДНК в вектор EA.hy926 эндотелиальные клетки, и конфокальной микроскопии с FRET, описаны более подробно ниже.
1. Строительство CFP и YFP Химерные рецепторы
Рецепторы интерес должен быть клонированы амино-неизлечимо к мономерной усовершенствованные версии CFP и YFP. Определение FRET является эмпирическим и в решающей степени зависит от длины линкера между трансмембранный охватывающих регион и начала флуорофор 1. Таким образом, несколько различных длин компоновщик должны быть изучены для каждой новой пары рецептор под следствием.
- Into pcDNA3.1 гигро R или нео R вектор, содержащий мономерных С-или YFP (этот вектор может быть получен из нашей лаборатории), клонировать рецептор интерес в NheI / EcoRI сайтах. * Примечание-При необходимости NheI совместимо ряд других ферментов, в том числе SpeI и XbaI.
- Превратите свой реакции лигирования в соответствующие компетентные endA1 гесА клеточной линии (мы обычно используем mach1). Экран колоний на наличие вставки следуют секвенирования ДНК, чтобы убедиться в отсутствии мутаций.
- После получения конформации успешной молекулярное клонирование, подготовить трансфекции класса векторной ДНК в стерилизованной воды или ТЕ использованием Qiagen, или аналогичные, наборы ДНК. Оценка концентрации и чистоты с помощью УФ-спектроскопии. Типичный выход ДНК должна быть в диапазоне 100-200 мкг, который обычно разбавляют до рабочей запас 1 мкг / мкл.
2. Трансфекция EA.hy 926 Клетки
- Сплит EA.hy 926 4 клетки, выращенные в полной-DMEM (DMEM +10% эмбриональной телячьей сыворотки + пен. / Strep.) В Маттек покровное (№ 0) 35 мм блюд с 2 мл среды. Вы можете получить консервативно ~ 15 блюд (~ 90% сливной следующий день) от 15 см сливной блюдо. Подготовка одно блюдо, чтобы вычислить значение выражения каждого рецептора, а также одно блюдо для каждого рецептора пары.
- Разрешить клетки инкубировать в течение ночи в 5% СО 2 атмосферы при температуре 37 ° C. На следующий день, культуры должны быть ~ 70-90% вырожденная.
- В день трансфекции, подготовить nucleolipid комплексов путем смешивания 2 мкг химерных ДНК вектора рецепторов (2 мкл) с 8 мкл Fugene6 в 200 мкл подогретого OptiMEM. Для рецепторов пар, трансфекции с 1 мкг каждого рецептора, на общую сумму 2 мкг (см. также ниже).
- Осторожно перемешать путем инверсии.
- Продолжить для инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Во время инкубационного периода, подготовки клеток для трансфекции. Аспирируйте от свежих средств массовой информации и мыть каждую пластину нежно и кратко теплым PBS перед добавлением 2 мл подогретого полную-DMEM без антибиотиков (DMEM + ФПС). Важно, чтобы избежать присутствия пенициллин и стрептомицин, так как они являются значительно более токсичны для клеток во время лечения Fugene6.
- Добавить комплекса падение мудрое к клеткам и инкубировать дополнительные 20-24 часов при температуре 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
- После 24 часов, тщательно аспирата средств массовой информации, из ячеек и пипетки свежий полный-DMEM с антибиотиками. После трансфекции, жизнеспособности клеток должны оставаться относительно высокими, то есть практически не плавающие клетки должны быть соблюдены.
- Экспрессия генов, как правило, максимальная после дополнительных 48-60 часов после трансфекции. Тем не менее, работы с изображениями, как правило, это возможно, в максимально коротким 24 часов. Время конечно экспериментов для оптимальной экспрессии гена должны быть выполнены.
3. Конфокальной микроскопии и анализа FRET
Живая клетка изображений осуществляется на Leica TCS-SP2 AOBS конфокальной лазерной сканирующей микроскопии оснащены голубой диод (405 нм), Аргон (458, 476, 488, 514 нм). зеленый HeNe (543 нм), гелий-неоновый оранжевый (594 нм) и гелий-неоновый красный (633 нм) лазеры, HCX П. Н. Апо 63x/1.3 глицерин-погружением объектива, моторизованные XY этапе (Märzhäuser), а также экологически управлением ( Температура, влажность и CO 2) стадия инкубатора (PeCon). Экспериментальные управления имеют решающее значение для устранения флуорофора перекрестных помех между каналами излучения, а также для оценки выражения мнения и неспецифические флуорофора multimerization. Таким образом, одной трансфекции флуорофора используются для настройки каждого изображения сессии. Отрицательные FRET управления (с помощью известных невзаимодействующих рецепторов) должны быть выполнены для того, чтобы определить фоне FRET, который происходит из-за чрезмерного выражения.
- Для устранения перекрестных помех между каналами для излучения CFP и YFP, место CFP контроль выражение в стадии инкубатора. Использование белого света, настроить Z-пластины, чтобы сосредоточиться нак клеткам.
- Установите параметры SP окно для обнаружения выбросов CFP к 465-505 нм и YFP на 525-600 нм.
- В процессе мониторинга выбросов и каналов, возбуждают CFP на 458 нм. Использование AOTF, установить мощность лазера для устранения заметного кровотечения из более CFP в канал выбросов YFP. Сохраните эту настройку.
- Выполните те же управления YFP перекрестных помех (с использованием YFP контроль выражение) в канале CFP, регулируя мощность возбуждения при 514 нм для клеток, экспрессирующих только YFP. Сохраните эту настройку.
- Следующая клетки места совместного выражения и CFP YFP в стадии инкубатора. Используя последовательность настройки для программного обеспечения Leica конфокальной, найдите клеток, экспрессирующих аналогичными уровнями CFP и YFP при правильной локализации мембраны.
- Использование программного обеспечения акцептор Leica фото-отбеливание программы, установить донора и акцептора настройки сохраненные CFP и YFP настройки, солидно.
- Масштабирование на ячейки, выделите ROI (область интереса), в котором фото-разрушения YFP должно произойти на клеточной мембране и начать программу.
- Для фото-разрушения акцептором, настроить AOTF до 100% при 514 нм и позволяет лазерное отбеливание, будет продолжаться до 70% выбросов YFP был исчерпан. Для ускорения отбеливания, трансформирования, как правило, выбрали по оси растр лазера (X-ось).
- Во время фото-отбеливание, монитор сотовой движения и отказаться от измерений, полученные с заметным движением в XY-плоскости, как эти измерения могут сообщать ложные FRET эффективности.
- Пре-и пост-отбеливатель изображения записываются как для донора (СФП) и акцепторных (YFP) и FRET эффективности рассчитывается по формуле: FRET Эфф = (D пост-D предварительно) / D сообщение для всех D сообщению> D, где D предварительно предварительно и D пост доноров интенсивности до и после фотообесцвечивания соответственно.
- JMP Программное обеспечение (SAS) используется для определения степени экспериментальной изменчивости.
4. Представитель Результаты
Трансфекция эффективности, как правило, от 30 до 40%. Несмотря на ранее полученные данные о других, мы не видели, что трансфекции и экспрессии один вектор, который выступает за другого. Действительно, мы часто наблюдаем эксклюзивные выражению одного флуорофора химера или другой стороны. Типичные FRET эффективности меняться в зависимости от рецепторных систем. Для системы рецептор Tie, типичные значения 20-28% для эпителиальных клеток и 19-23% в эндотелиальных клетках. Для отрицательного контроля, типичный КПД ниже 2-3%. Степень изменчивости значительно уменьшится с опытом.
Рисунок 1. Представитель изображения трансфицированных EA.hy 926 клеток.) DIC образ EA.hy 926 клеточный монослой. Б) изображение флуоресценции клеток отображается в (А). С) Наложение (А) и (Б) демонстрация ~ 20-30% эффективности трансфекции.
Рисунок 2. Представитель акцептором фото-отбеливание анализ FRET, возникающие между КФП и YFP в EA.hy926 клетки. CFP эмиссионного канала (верхней панели) и YFP эмиссионного канала (две нижние панели) были отслеживаться отдельно до и после акцептором фотообесцвечивания. Фотообесцвечивания эксперименты были ограничены, и FRET значения, рассчитанные из, регион в зеленом поле. FRET эффективности отображается как абсолютный диапазон от высоких (красно-1.0) к низкому (пурпурно-0.0) на увеличенное наложение CFP / YFP объединенного изображения для ориентации целей.
Discussion
Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для успеха. Наиболее видным из них является относительным уровнем экспрессии между двумя химерных рецепторов. Чтобы обойти эту проблему, можно сделать стабильные клеточные линии выражения обоих белков интереса, или определить оптимальные соотношения векторной ДНК, чтобы разрешение эквивалентное выражение. Кроме того, из-за неоднородного трансфекции по блюду, белка редко когда будет эквивалент между клетками. Таким образом, внимание должно быть уделено различать "высокие" expressors от «низкого». Те, что уровень «средней» дисплей белка обычно дают надежные и воспроизводимые FRET эффективности. Один из методов нашей лаборатории проводит для облегчения этой проблемы является использование адено-и Lenti вирусы 'даже' экспрессии генов. Кроме того, альтернативный метод акцептором фото-отбеливание для определения эффективности FRET сенсибилизирован выбросов. Хотя, несмотря на потенциальную сенсибилизированных выбросов для контроля отдельных клеток в реальном времени, мы нашли акцептором фото-отбеливание, более чувствителен и более надежным.
Наконец, используя FRET для мониторинга белковых взаимодействий может быть сложным и требует тщательного подбора длины линкера для мембраносвязанных рецепторов. Кроме того, добавление C / YFP часто сильно влияет на экспрессию белка уровнях и приводит к агрегации в эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. Однако, для переходных или нестабильной, взаимодействия, FRET является идеальной методологией использовать.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотим выразить признательность д-р Скотт Хендерсон за помощь в конфокальной микроскопии. Это исследование было поддержано грантами от Национального института здоровья 1RO1CA127501 к WAB, а также финансирование пилотного проекта из Центра Massey рака и школы медицины (VCU) для микроскопии WAB была выполнена в VCU-департамента. нейробиологии и анатомии микроскопии фонда, при поддержке, в частности, при финансовой поддержке Центра NIHNINDS основной грант 5P30NS047463.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).
