Summary
גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה ג'יימס להזריק dsRNA לנקבה א aegypti יתושים, אשר בנמל וירוס דנגה. הטכניקה לכיול מחטי הזרקה, מניפולציה של ההתקנה הזרקה, והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.
Abstract
גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה ג'יימס להזריק dsRNA לנקבה א aegypti יתושים, אשר בנמל וירוס דנגה. הטכניקה לכיול מחטי הזרקה, מניפולציה של ההתקנה הזרקה, והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.
Protocol
- הפוך את המחטים microinjection ידי משיכת צינורות זכוכית נימי. אנו משתמשים חולץ מחט מ CO כלי סאטר, (דגם P-2000). חולץ מחט מפרטי התוכנית הם:
חום: 275
fil: 3
לוול ךיב: 37
דל: 250
pul: 125 - טען נפח ידוע (למשל, 1 μl) של מים המחטים באופן ידני לציון בקנה מידה עם לנוכל בסדר.
- הגדרת כוס שלאחר הזרקת עבור היתושים. ראשית לחתוך את קצה קצוני מעל קצה 1000 פיפטה μl. לאחר מכן, לחתוך חור בצד כוס ולהכניס את החלק הנותר של קצה פיפטה בגביע. שים רשת או מכסה על גבי הספל.
- מלאו שתי קופסאות קלקר עם קרח. קרח המקום תיבת # 1 תחת stereomicroscope ובמקום watchglass זכוכית על הקרח.
- הרדימי היתושים הבוגרים עם CO 2 ו כוס מקום עם מבוגרים בתיבת קרח # 2.
- הכן מחט להזרקה של dsRNA. מכניסים מחט מלא dsRNA על צינור הפלסטיק של לחסום זריקה (לתיאור לחסום זריקה ראה להלן).
- העברת יתושים מרדים מכוס לכוס את השעון עם מלקחיים. הפסקת מחט הזריקה טיפ לציפורן יתושים. מחק את היתושים.
- עבור זריקות, המחט מוחדרת לתוך בית החזה של היתוש. עם יד חופשית שלך, להתאים את שסתום על ההזרקה של "תנוחת המנוחה" ל "עמדת זריקה" ו לדחוס הבוכנה עד לסכום הרצוי dsRNA כבר הזריק.
- המקום מוזרק יתוש לתוך כוס שלאחר ההזרקה.
לחסום הזרקה להגדיר
- תקן מזרק 50 מ"ל לגוש פחם שרוף.
- צרף שסתום מתכווננת 1-בדרך לסוף המזרק עם לפחות 2 חנויות האוויר.
- צרף צינור פלסטיק אטום לשקע 1 האוויר.
- הכנס מתאם micropipette אל הקצה החופשי של הצינור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
