Summary
Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll zeigt eine Methode, mit der James-Labor verwendet werden, um dsRNA in weibliche A. aegypti Moskitos, die Dengue-Virus Hafen zu injizieren. Die Technik für die Kalibrierung von Injektionsnadeln, die Manipulation der Injektion Setup, und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.
Abstract
Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll zeigt eine Methode, mit der James-Labor verwendet werden, um dsRNA in weibliche A. aegypti Moskitos, die Dengue-Virus Hafen zu injizieren. Die Technik für die Kalibrierung von Injektionsnadeln, die Manipulation der Injektion Setup, und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.
Protocol
- Machen Mikroinjektion Nadeln, indem Glaskapillaren. Wir verwenden eine Nadel puller von Sutter Instrument CO, (Modell P-2000). Die Nadel-Abzieher-Programm Spezifikationen sind:
Hitze: 275
fil: 3
vel: 37
del: 250
pul: 125 - Legen Sie ein bekanntes Volumen (zB 1 ul) von Wasser in den Nadeln und manuell die Skala mit einem feinen Sharpie.
- Richten Sie eine Nacheinspritzung Pokal für die Moskitos. Zuerst schneiden die äußerste Spitze weg von einer 1000 ul Pipettenspitze. Dann schneiden Sie ein Loch in der Seite eine Tasse und legen Sie den restlichen Teil der Pipettenspitze in die Tasse. Setzen Sie ein Netz oder Deckel auf der Pfanne.
- Füllen zwei Styropor-Kisten mit Eis. Legen Sie Eis box # 1 unter einem Stereomikroskop und stellen Sie ein Glas Uhrglas auf dem Eis.
- Anesthetize der erwachsenen Mücken mit CO 2 und Platz Tasse mit Erwachsenen in ice box # 2.
- Bereiten Nadel für die Injektion von dsRNA. Legen Sie Nadel mit dsRNA auf dem Kunststoffschlauch der Injektion Block gefüllt (für die Beschreibung der Einspritzblock siehe unten).
- Verschieben eines narkotisierten Mücke aus dem Becher der Uhrglas mit einer Pinzette. Pause Injektionsnadel Spitze auf Moskito Nagelhaut. Entsorgen Sie diese Mücke.
- Für Injektionen wird die Nadel in den Brustkorb des Moskitos eingesetzt. Mit der freien Hand, passen Ventil am Injektor von "Ruheposition" auf "Injektion Position" und komprimieren Kolben, bis die gewünschte Menge an dsRNA injiziert wurde.
- Ort injiziert Mücke in Nacheinspritzung Tasse.
Injection Block einrichten
- Fix eine 50 ml Spritze ein Betonklotz.
- Bringen Sie eine einstellbare 1-Wege-Ventil bis zum Ende der Spritze mit mindestens 2 Luftauslässe.
- Bringen Sie einen luftdichten Kunststoffschlauch bis 1 Luftauslass.
- Legen Sie eine Mikropipette Adapter in das freie Ende des Schlauches.
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