Injeção de dsRNA em Mosquitos Feminino A. aegypti

Summary

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório de James para injetar dsRNA em fêmeas de mosquitos A. aegypti, que abrigam o vírus da dengue. A técnica para a calibração de agulhas de injeção, manipulando a configuração da injeção, e injetando dsRNA no tórax é ilustrado.

Abstract

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório de James para injetar dsRNA em fêmeas de mosquitos A. aegypti, que abrigam o vírus da dengue. A técnica para a calibração de agulhas de injeção, manipulando a configuração da injeção, e injetando dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocol

1. Faça agulhas microinjeção puxando tubos capilares de vidro. Usamos um extrator de agulhas de Sutter CO Instrumento, (modelo P-2000). A agulha especificações do programa extrator são:
   
   calor: 275
   fil: 3
   vel: 37
   del: 250
   pul: 125
   
   
2. Carregar um volume conhecido (por exemplo, 1 ml) de água nas agulhas e marcar manualmente a escala com um sharpie bem.
3. Configurar um copo após a injecção para os mosquitos. Primeiro corte a ponta outmost fora de uma ponta da pipeta 1000 mL. Então, cortar um buraco na lateral de um copo e coloque a parte restante da ponta da pipeta no copo. Coloque uma rede ou tampa na parte superior do cálice.
4. Preencher duas caixas de isopor com gelo. Caixa de colocar gelo # 1, sob um estereomicroscópio e colocar um vidro de relógio de vidro sobre o gelo.
5. Anestesiar os mosquitos adultos com CO ₂ e copo lugar com adultos em caixa de gelo # 2.
6. Prepare agulha para a injecção de dsRNA. Coloque agulha cheia de dsRNA na mangueira de plástico do bloco de injeção (para uma descrição do bloco de injeção veja abaixo).
7. Mover um mosquito anestesiados da taça para o vidro de relógio com uma pinça. Ruptura de ponta de agulha de injeção na cutícula mosquito. Descartar este mosquito.
8. Para injectáveis, a agulha é inserida no tórax do mosquito. Com a outra mão, ajuste da válvula de injeção de "posição de repouso" para "posição de injeção" e comprimir o êmbolo até a quantidade desejada de dsRNA foi injetado.
9. Lugar injetado mosquito em pós-injeção copo.

Bloco de injeção configurado

1. Fixar uma seringa de 50 ml a um bloco de concreto.
   
2. Anexar uma válvula de uma maneira ajustável para o fim da seringa com pelo menos 2 saídas de ar.
   
3. Anexar uma mangueira de plástico hermeticamente fechado para uma saída de ar.
   
4. Inserir um adaptador micropipeta na extremidade livre da mangueira.