Summary
Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire de James à injecter dans les ARNdb femelles moustiques A. aegypti, qui abritent le virus de la dengue. La technique pour l'étalonnage des aiguilles d'injection, de manipuler la configuration d'injection, et l'injection ARNdb dans le thorax est illustré.
Abstract
Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire de James à injecter dans les ARNdb femelles moustiques A. aegypti, qui abritent le virus de la dengue. La technique pour l'étalonnage des aiguilles d'injection, de manipuler la configuration d'injection, et l'injection ARNdb dans le thorax est illustré.
Protocol
- Faire des aiguilles de microinjection en tirant des tubes capillaires en verre. Nous utilisons un extracteur d'aiguilles à partir du CO Instrument Sutter, (modèle P-2000). Les spécifications d'aiguille extracteur programme sont:
la chaleur: 275
Fil: 3
vel: 37
del: 250
Pul: 125 - Charger un volume connu (par exemple, 1 pi) d'eau dans les aiguilles et les marquer manuellement la balance avec un Sharpie fine.
- Mettre en place une tasse de post-injection pour les moustiques. D'abord couper la pointe plus haute hors d'un embout de pipette 1000 pi. Ensuite, découpez un trou dans le côté d'une tasse et insérer la partie restante de la pointe de la pipette dans la tasse. Mettez un filet ou un couvercle sur le dessus de la tasse.
- Remplir deux boîtes de styromousse avec la glace. Boîte de glace de la Place n ° 1 sous un stéréomicroscope et le lieu de verre un verre de montre sur la glace.
- Anesthésier les moustiques adultes avec le CO 2 et la Coupe du lieu avec les adultes dans la boîte de glace # 2.
- Préparer l'aiguille pour l'injection d'ARNdb. Mettez l'aiguille remplie d'ARNdb sur le tuyau en plastique du bloc d'injection (pour la description du bloc d'injection voir ci-dessous).
- Déplacer un moustique anesthésiées de la tasse pour le verre de montre avec une pince. Pause pointe de l'aiguille d'injection sur la cuticule des moustiques. Jeter ce moustique.
- Pour les injections, l'aiguille est insérée dans le thorax du moustique. Avec votre main libre, régler la vanne sur l'injecteur de «position de repos" à "la position d'injection" et compresser piston jusqu'à la quantité désirée d'ARNdb a été injecté.
- Placez injecté moustiques en post-injection tasse.
Bloc d'injection mis en place
- Fixer une seringue de 50 ml à un bloc de ciment.
- Attacher une réglable 1 clapet anti-retour à l'extrémité de la seringue avec au moins deux sorties d'air.
- Fixez un tuyau en plastique hermétique pour une sortie d'air.
- Insérez un adaptateur micropipette dans l'extrémité libre du tuyau.
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