Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Summary

Эта работа показывает, как форма РНК / ДНК гибридной на хромосомном уровне и выявить передачи генетической информации от РНК к геномной ДНК в клетках дрожжей.

Abstract

Синтетические короткие нуклеиновых кислот полимеры, олигонуклеотиды (олигонуклеотиды), являются наиболее функциональных и распространенных инструментов молекулярной биологии. Олигонуклеотидов могут быть произведены содержать любую ДНК или РНК, последовательность и могут быть готовы включить широкий спектр базовых и сахар модификаций. Более того, олигонуклеотиды могут быть разработаны для имитации конкретных нуклеиновые кислоты изменений и, таким образом, может служить важным инструментом для исследования последствий повреждения ДНК и механизмов ремонта. Мы обнаружили, что Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олигонуклеотидов с длиной от 50 до 80 нуклеотидов может быть особенно подходящим для изучения, в естественных условиях, функции и последствия хромосомных РНК / ДНК гибридов и рибонуклеотидов встроенные в ДНК. РНК / ДНК гибридов легко образуются во время репликации ДНК, ремонт и транскрипции, однако, очень мало известно о стабильности РНК / ДНК гибридов в клетках и в какой степени эти гибриды могут повлиять на генетической целостности клеток. РНК-содержащих олигонуклеотидов, следовательно, представляют собой идеальный вектор ввести рибонуклеотидов в хромосомной ДНК и создания РНК / ДНК гибридов выбранной длины и базового состава. Здесь мы приводим протокол для включения рибонуклеотидов в геном эукариотической дрожжей модели системы / Saccharomyces CEREVISIAE /. Тем не менее, наша лаборатория использовала Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олигонуклеотидов для создания РНК / ДНК гибридов на хромосомном уровне в различных клеточных систем, от бактерий до клеток человека.

Protocol

Обоснование

Использование использовании Thermo Scientific Dharmacon олигонуклеотидов, от 50 до 80-меров, здесь мы представляем процедура, основанная на анализе гена коррекции, в котором олигонуклеотиды могут передавать генетическую информацию для геномной ДНК дрожжевых клеток, после отжига до цели хромосомной ДНК. Успешное таргетинг по олигонуклеотидов забил появление колоний дрожжей отображения ожидаемого фенотипа. Если нужный генетическая модификация осуществляется в течение одного или более рибонуклеотидов включены в последовательность олиго, генетическая информация, непосредственно вытекает из путей РНК хромосомной ДНК-мишени, таким образом, РНК / ДНК гибридных форм на хромосомном уровне в течение ориентации процесса. Рибонуклеотид / с Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олиго могут служить в качестве шаблона для генное планирование через синтез ДНК ремонт или может быть встроен в ДНК и служат в качестве шаблона во время репликации ДНК. В этих экспериментах мы используем дрожжи / Saccharomyces CEREVISIAE / эукариотической модели системы, однако подобный подход может быть применен и в других организмах или клеточных типов. В этом видео мы используем Thermo Scientific Dharmacon олиго разработан с гомологии генома дрожжей локус цели и содержащие один рибонуклеотид в середине исправить мутацию в ген-мишень. После преобразования с РНК-содержащих олиго, мы наблюдаем коррекцию целевой сайт с определенной частотой, что свидетельствует о путях РНК олиго могут быть включены в хромосомной ДНК и служат в качестве матрицы для синтеза ДНК во время репликации ДНК. Генетической информации, передаваемой в РНК тракта стабильно передается следующим поколениям клеток. Здесь мы опишем шаги трансформации клеток дрожжей от Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олиго и подход для выявления информационной РНК передаче в хромосомной ДНК.

А. Разработка РНК-содержащих Oligo, используемые в этом эксперименте

Мы разработали РНК-содержащих олиго исправить генетический дефект дрожжей S. CEREVISIAE хромосомной ДНК в trp5 локуса. Штамм дрожжей, используемых в протоколе содержится мутантный ген с trp5 двуосновных удаление и один нонсенс-мутации (рис. 1А). Такой штамм дрожжей триптофан мутант ауксотрофных и не образует колонии на среде без триптофана. Последовательность ДНК гена TRP5 доступен по адресу База данных Saccharomyces генома (http://www.yeastgenome.org/). Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олиго используется в данный протокол 65-Мер с 2-базу ДНК вставки, предназначенные для исправления мутаций удаление и один рибонуклеотид направленных на корректировку ерунда мутации trp5 аллели (рис. 1А). Последовательность олиго предназначен следующим образом:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Это олиго синтезируется Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) при 200 нм масштабе, и обессоленной, снимают защиту и использоваться без СТРАНИЦА очистки.

В. Подготовка РНК-содержащих Oligo для дрожжей Трансформация (изменение от Storici и соавт., 2007 ¹⁾

1. Протрите материалы, которые будут использоваться для эксперимента в том числе олиго труб, пипеток, вихревых, стеллажи, экспериментальной площадкой и перчатки носили следователь РНКазой обеззараживание раствором для удаления возможного загрязнения РНКазы, прежде чем все начинается. Используйте РНКазы без воды, химические реагенты, трубы и наконечники на всех этапах. Каждый шаг в этом эксперименте должны быть РНКазы бесплатно.
2. Ресуспендируют Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олиго получили от компании до 250 пмоль / мкл исходного раствора РНКазой без воды и вихрь активно растворять таблетки. Хранить при температуре -80 ° C.
3. Непосредственно перед преобразованием, оттепель РНК-содержащих олиго на лед и разбавить до 50 пмоль / мкл РНКазы свободной воды в РНКазы без труб. Каждое преобразование требует 1 нмоль от РНК-содержащих олигонуклеотидов.
4. Денатурировать выбрали количество РНК-содержащих олигонуклеотидов на 100 ° C тепла блока в течение 2 мин для устранения вторичной структуры олигонуклеотидов.
5. Сразу же после денатурации место трубки на льду. Держите на льду до преобразования.
6. В качестве контроля в эксперименте соответствующие ДНК-только олиго используется. Это олиго оттаивают от -20 ° С и подготовлены к трансформации как РНК-содержащих олиго, как описано выше.

С. Преобразование дрожжевых клеток использованием РНК-содержащих Oligo

1. Привить 5 мл богатых YPD жидкой среде с trp5 мутантных клеток дрожжей и расти при температуре 30 ° С в течение ночи (см. материалы).
2. Передача 1,5 мл ночной культуры в 50 мл YPD жидкой среде.
3. Инкубируйте клетки в 30 ° C шейкере (225 оборотов в минуту) в течение 4 часов.
4. Подготовка Решение 1 Решение 2 и IMMediately до преобразования в РНКазы без трубы (см. материалы).
5. Передача культуры клеток в 50 мл РНКазы без трубки и спина при 3000 оборотов в минуту, что соответствует 1562 г, в течение 2 мин. Гранулы ячейки осадков составляет ок. 0,3 см ^3.
6. Удалить супернатант и промыть клетки с 50 мл РНКазы без воды и спина при 3000 оборотов в минуту в течение 2 мин.
7. Повторите шаг 6 в 5 раз, чтобы избавиться от питательной среды и РНКазы, которые могут присутствовать в среде, насколько это возможно.
8. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 5 мл раствора 1 и спина при 3000 оборотов в минуту в течение 2 мин.
9. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 250 мкл раствора 1. Эта сумма клеток достаточно для 7-8 преобразований.
10. Алиготе 50 мкл суспензии клеток в РНКазы без труб микроцентрифужных, добавить 20 мкл РНК-содержащих олиго рабочего раствора (1 нмоль), или 20 мкл ДНК-только олиго рабочего раствора (1 нмоль), или 20 мкл стерильной воды без каких-либо олиго для отрицательного контроля. Затем добавьте 300 мкл Решение 2 для каждого преобразования реакции. Существует никакой необходимости добавлять ДНК спермы лосося в процессе трансформации, как действовать олигонуклеотидов в качестве носителя себя.
11. Vortex энергично перемешать компоненты однородно.
12. Инкубируйте трансформация реакции при 30 ° С в течение 30 мин в шейкере.
13. Теплового шока при 42 ° С в течение 15 мин.
14. Спином вниз клеток при 5000 оборотов в минуту, что соответствует 2236 г, в течение 4 мин.
15. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл стерильной воды.
16. Возьмите аликвоту этой клеточной суспензии и разбавить ее стерильной водой на 100.000 раз, а пластина ячеек на один YPD пластины с использованием ок. 15 стерильные стеклянные бусы и инкубировать при температуре 30 ° С в течение 2 дней.
17. Пластина все ресуспендировали клетки от каждого преобразования реакции на одну чашку Петри синтетических полный твердой среде без триптофана (SC-Trp), используя ок. 15 стерильные стеклянные бусы и инкубировать при 30 ° С в течение 4-5 дней (рис. 2).

D. Анализ генов возможности исправления РНК-содержащих Oligo

1. Подсчитайте количество колоний, выросших на селективной среде (рис. 2), а также на YPD среда для расчета частоты генов коррекции для РНК-содержащих олиго, ДНК-только олиго и для не-олиго контроля. Сравните число, полученное. Спонтанное ставка реверсии trp5 аллелей с двуосновных удалений и нонсенс-мутации составляет менее 10-9 в использован штамм дрожжей, поэтому мы не ожидаем формирование колоний на селективной среде, когда не олигонуклеотидов добавляют к клеткам.
2. Подряд из нескольких случайно выбрал трансформированных колоний на YPD средой для получения одного изолирует колонии. Подождите два дня для роста колоний, а затем взять несколько (по крайней мере 5) отдельных колоний и создание патчей на YPD и на селективной среде.
3. Дизайн пары праймеров для амплификации области (250-1,000 б.п.), ориентированные на РНК-содержащих олиго по колонии ПЦР (рис. 1В). Процедура колонии PCR выглядит следующим образом (изменение от Storici и Резник, 2006 г. ^2).
   1. Ресуспендируют клетки (около 1 мм3), взятых из отдельных патчей в 50 мкл воды и добавить 1 единицу lyticase. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин, с последующей инкубацией в жару блока при 100 ° С в течение 5 мин до перерыва клетки и выпустить геномной ДНК в растворе.
   2. Условия ПЦР: ПЦР включает в себя 10 мкл раствора ресуспендирования клетка, 50 пмоль каждого из прямого и обратного праймера, 1 мкл 10 мМ дНТФ, 1 единицу Taq-полимеразы, 5 мкл 10х буфера и регулируется с помощью стерильной водой конечного объема 50 мкл. Программа ПЦР 3 мин при 95 ° C, 30 циклов 30 с при 95 ° С, 30 с при 55 ° С и 1 мин при 72 ° С; последний раз расширение 7 мин при 72 ° С, затем образцы хранятся при 4 ° C. Расширение время 1 мин / кб предполагается для этой реакции.
   3. После ПЦР, образцы выполняются на 1% или 2% (в зависимости от ожидаемого размера продукта ПЦР) агарозном геле для наблюдения продуктов ПЦР (рис. 3).
4. Если генетическая информация передается от РНК-содержащих олиго создает новый сайт рестрикции в целевом регионе генома дрожжей (рис. 1Б), можно проверить правильность передачи информации путем переваривания продуктов ПЦР с соответствующим ферментом рестрикции. Если ни один сайт рестрикции порожден РНК-содержащих олиго, переходите к шагу 6. Дайджест продуктов ПЦР с помощью специального фермента ограничений. Пищеварения реакция включает в себя 6 мкл ПЦР продукта, буфер, BSA (не могут быть необходимы для некоторых ферментов, см. инструкцию для фермента используется), 0,5 мкл рестрикции, и стерильной воды до 15 мкл. Образцы инкубировали 1 ч при температуре, специфичные для фермента используется.
5. Выполнить непереваренные образца вместе с переваривается образцов на одной строке 2% агарозном геле наблюдать генетической модификации передаются бу тракта РНК РНК-содержащих олиго (рис. 3).
6. Purify продуктов ПЦР с помощью ПЦР-комплект очистки и подготовки их к секвенирования ДНК. Отправить образцов для секвенирования с тем же праймеры, используемые для усиления продукта.
7. Анализ результатов секвенирования ДНК с помощью программного обеспечения, которое позволяет выравнивание нескольких последовательностей с выбранной ссылкой последовательности (рис. 4).

Е. щелочной обработки РНК-содержащих олиго (рис. 5)

1. Для каждой реакции, добавить 1 нмоль (4 мкл 250 пмоль / мкл раствора сырье) РНК-содержащих олиго или ДНК-олиго в 1,5 мл трубки.
2. Добавьте 4 мкл 1 M NaOH для гидролиза, или же добавить 4 мкл H ₂ O в качестве отрицательного контроля, и инкубировать при температуре 65 ° С на водяной бане в течение 1 ч. Затем перейти от водяной бане в лед.
3. Нейтрализовать с 2 мкл 1,2 М HCl, 4 мкл 1 М Трис-HCl, и 4 мкл H ₂ O, или же 6 мкл H ₂ O и 4 мкл 1 М Трис-HCl для отрицательного контроля. Держите на льду до преобразования.

Рисунок 1. Принципиальная схема дефектного гена trp5 и TRP5 аллель исправлены РНК-содержащих олиго.) Trp5 мутантный ген содержит 2-база удаления (черные треугольники) и 1-база нонсенс-мутации (звездочка). Однонитевые РНК-содержащих олиго с 2-база вставки (синий контур) и 1-РНК заменой оснований (красный прямоугольник), порождающие Van91 я рестриктазы сайт (показано кронштейн) преобразуется в клетках дрожжей для исправления генетических дефектов из trp5 гена. B) После TRP5 гена, ремонтируется путем РНК-содержащих олиго (исправлено базы обозначены как синие прямоугольники), сайт Van91 я генерируется в TRP5 гена. Фрагмент 278 б.п. в том числе только один Van91 я сайт рестрикции в TRP5 ген ПЦР усиливается пары праймеров (P1 и P2). 177 б.п. и 101 б.п. фрагменты, возникающие после переваривания P1 и P2 ПЦР продукта Van91 Я также показаны.

Рисунок 2. Преобразование результата с РНК-содержащих олиго.) Дрожжи клеток, трансформированных не олиго не образуют колонии на SC-Trp среды, увидеть пластины AB. B) Плиты CG-шоу дрожжей колоний, растущих на SC-Trp после клетки трансформируют с 1 нмоль от РНК-содержащих олиго. C) Плиты гл показать дрожжей колоний, растущих на SC-Trp после клетки трансформируют с 1 нмоль соответствующей ДНК-только олиго контроля.

Рисунок 3. Выявление генетической передачи информации от РНК-содержащих олиго в хромосомной ДНК дрожжей ограничением переваривания продуктов ПЦР усиливающих целевом регионе генома. 2% агарозном гель-электрофореза ПЦР образцы усиливается P1 и P2 и переваривают Van91 я рестрикции. Дорожки 1, 8 и 15, лестницы ДНК с размерами 100, 200, 300, 400 и 500 б.п. указанные слева, переулок 2, ПЦР-продукт trp5 локус усиливается из геномной ДНК trp5 мутантный штамм, переулок 3, ПЦР продукт усиленный из геномной ДНК получен из колонии Trp + мишенью для ДНК-только олиго; переулок 4-7, продуктов ПЦР амплифицировали из геномной ДНК основе Trp + колонии мишенью РНК-содержащих олиго; переулок 9 до 14, Van91 я рестрикцией из продуктов ПЦР из полос 2 до 7. Наличие необработанных продуктов ПЦР полосы на дорожках 10 до 14 может быть объяснено частичным пищеварение Van91 я в TRP5 локус (CCACATTCTGG). Учитывая, что сайт для резки Van91 I (CCANNNN NTGG) может иметь несколько последовательностей, на сайте генерируется в TRP5 не может быть наиболее оптимальным мишенью для фермента. На самом деле, после секвенирования ДНК всех вышеуказанных продуктов ПЦР мы обнаруживаем никаких дополнительных изменений, кроме тех, перевозимых олигонуклеотиды (см. рисунок 4). 278 б.п. ПЦР группы усиливается P1 и P2, грунтовки и полосы пищеварения продукт Van91 я на 177 б.п. и 101 б.п. показаны стрелками справа.

Рисунок 4. Секвенирования ДНК результаты, показывающие, ген коррекции РНК-содержащих олиго.) ДНК electropherogram из генома мишенью РНК-содержащих олиго. G в последовательности ДНК (синий коробках) происходит от RG на РНК-содержащих олиго. Также коробке находится вставка из основ компьютерной графики. Последовательность результатов от всех других продуктов ПЦР, также ясно, как этот, с флуоресцентные сигналы значительно выше фона. Б) Последовательности TRP5 области Trp + Трансформаторrmants мишенью для ДНК-только олиго (T1) и РНК-содержащих олиго (Т2-Т5) матч в консенсусной последовательности на вершине и по сравнению с trp5 мутантных клеток до таргетинг по олигонуклеотидов (Геномная ДНК, красный заштрихована). Ремонт РНК-содержащих олиго на дно две базы вставки ДНК и одной базы (G) РНК замещение отмечены красным цветом. Регионов загнала вас в угол синий с желтым показать оттенок, который РНК-содержащих олиго а также ДНК-только олиго точно исправлены мутации удаления и нонсенс-мутации во всех тестируемых образцов. Штриховой линиями отмечены положения РНК-содержащий последовательность олиго. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 4.

Рисунок 5. Щелочные лечение предотвращает гена коррекции РНК-содержащих олиго. Преобразования частоты на РНК-содержащих олиго (R) показана на красной полосой и что, только ДНК-олиго (D) показана на синих баров. Погрешности представляют стандартная ошибка среднего для 3 независимых преобразований для каждого олиго. ДНК-только олиго с подобным преобразованием частоты и без лечения NaOH. Иными словами, преобразование частоты на РНК-содержащих олиго падает до 0 после лечения NaOH. Таким образом, препарат с РНК-содержащих олиго не загрязнена с ДНК только олиго, таким образом, наблюдаемая частота преобразования специфичен для РНК-содержащих олиго.

Discussion

Тот факт, что РНК может передавать генетическую информацию непосредственно геномной ДНК в клетках было обнаружено использование использование синтетических РНК-содержащих олигонуклеотидов (Dharmacon синтезированных олигонуклеотидов) ^1. Это было доказательством принципа, что клетки могут использовать РНК-содержащих молекул или РНК-последовательностей, только в качестве шаблонов для синтеза ДНК. Использовать РНК-содержащих олигонуклеотидов не только привело к демонстрации того, что генетическая информация может быть передана непосредственно от РНК к геномной ДНК без необходимости обратной транскрипции ДНК-копию промежуточного, но и доказательство того, что РНК может быть использован в качестве шаблона в гомологичных ремонт повреждений ДНК ^1,3. Олигонуклеотидов могут быть изготовлены из РНК-содержащие или содержащие только одно рибонуклеотид встроенные в ДНК последовательности, как в примере, мы представили здесь. РНК-содержащих олиго имеет один встроенный рибонуклеотид направленных на корректировку нонсенс-мутации в геномной дефектных trp5 аллеля. Передачи генетической информации от рибонуклеотид в геномной ДНК проявляется изменением фенотипа (клетка, растущих на среде отсутствует триптофан) из клеток-мишеней. Частота гена коррекции, полученные с РНК-содержащих олиго измеряется и по сравнению с контролем ДНК-только олиго. Выполняя этот анализ генов коррекции в разных слоев клетки, где мы мутировать различных генов дрожжей, мы можем обнаружить, какой фактор / с затрагивающих таргетинг по РНК-содержащих олигонуклеотидов. Таким образом, мы можем выявить механизмы, как клетки регулируют стабильность РНК / ДНК гибридов. Просто проектирования различных вариантов РНК-содержащих олигонуклеотидов можно определить вероятность для конкретного тракта РНК в качестве шаблона в ДНК, модификации и мы можем определить устойчивость специфические последовательности РНК, встроенные в ДНК. Более того, мы можем определить, что является предпочтительным в естественных субстратов для факторов, взаимодействующих с РНК / ДНК гибридов.

Хотя некоторые лабораторные исследования, в основном используя короткие РНК-содержащих олигонуклеотидов, были проведены, чтобы охарактеризовать функции факторов, которые могут распознать РНК гибрид с ДНК, например, ферментов РНКазы H ^4, в естественных функций РНКазы H, а как личность других белков, которые могут повлиять РНК / ДНК гибридных стабильности остаются по большей части неизвестна. Возможность использовать РНК-содержащих олигонуклеотидов значительной длины (от 50 до 80-меров) и оптимального качества (например, Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олигонуклеотидов) имеет открыть путь к изучению широкого спектра молекулярных процессов непосредственно в естественных условиях в Клетки интерес. Как показано в этом видео, преобразование с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов требует по существу, лишь несколько дополнительных шагов по сравнению с преобразованием при помощи ДНК-молекул, в целях предотвращения деградации РНКазы. Таким образом, преобразование с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов не ограничивается дрожжей системы, но может быть применен к любой организм или тип клеток, где трансформация ДНК-олигонуклеотиды владеет.

В заключение ориентации клеток РНК-содержащих олигонуклеотидов дает возможность получать РНК / ДНК гибридов и рибонуклеотидов встроенные в ДНК в естественных условиях в клетках. Стабильность, функции и последствия этих порожденных в естественных условиях РНК / ДНК гибриды могут быть проанализированы и характеризуется, потенциально раскрытие неизвестных механизмов репарации ДНК и выявление новых стратегий для генного таргетинга.

Materials

A. Transformation reagents and media (modified from Storici and Resnick, 2006

YPD (Yeast Peptone Dextrose): For 1 L, 10 g yeast extract, 20 g soy peptone, 20 g dextrose. Add 15 g agar to make YPD solid media. Autoclave before use. Store at room temperature. Solution 1: 0.1 M of lithium acetate. Prepare immediately before transformation. Solution 1 is a working solution, thus it is prepared directly from the powder. No stock solution is made. Keep at room temperature. LiAc increases the yeast cell wall permeability to DNA. Solution 2: 0.1 M of lithium acetate and 50 % of polyethylene glycol 4000. Also solution 2 is a working solution and it is made directly from the powder. No stock solution is prepared. Keep at room temperature. PEG deposits oligos onto yeast cells. RNA-containing oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalted, deprotected and non-purified. Resuspend to 250 pmoles/μl. Store at -80 °C. DNA-only oligos, 50-80-mers, desalted and non-purified. Resuspend to 50 pmoles/μl. Store at -20 °C. SC-Trp (Synthetic complete media lacking tryptophan) solid media. 0.5 cm diameter glass beads, sterilized by autoclaving. RNase-off: RNase decontamination solution. DNase/RNase-free, sterile centrifuge tubes. DNase/RNase-free, sterile conical tubes. DNase/RNase-free, sterile aerosol pipette tips with ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml.

B. Colony PCR materials.

DNA primers, desalted and non-purified. Dissolve in sterile water to 50 pmoles/μl. Store at -20 °C. Taq DNA polymerase, buffer, dNTPs. PCR tubes.

C. PCR purification.

PCR purification kit.

D. Gel Electrophoresis.

Agarose. 1 x TBE running buffer (45 mM Tris-borate and 1 mM ethylenediamine tetraacetate) diluted from 10x TBE. Prestained molecular weight marker. DNA loading dye.

E. Restriction digestion.

Restriction enzymes, 10x buffers, BSA.

F. Alkali treatment for the RNA-containing oligo.

1 M of NaOH solution. 1.2 M of HCl solution. 1 M of Tris-HCl, pH 7.4 solution.