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Biology

जीनोमिक डीएनए / आरएनए और डीएनए संकर की शाही सेना युक्त परिवर्तन का उपयोग कर oligonucleotides द्वारा जनरेशन

doi: 10.3791/2152 Published: November 24, 2010

Summary

इस काम से पता चलता है कैसे गुणसूत्र के स्तर पर / शाही सेना डीएनए संकर फार्म और शाही सेना से आनुवंशिक जानकारी के हस्तांतरण के जीनोमिक डीएनए के लिए खमीर कोशिकाओं में प्रकट.

Abstract

सिंथेटिक कम न्यूक्लिक एसिड पॉलिमर oligonucleotides (oligos), आण्विक जीव विज्ञान की सबसे कार्यात्मक और व्यापक उपकरण हैं. Oligos के लिए किसी भी वांछित डीएनए या शाही सेना अनुक्रम होते हैं उत्पादन किया जा सकता है और बेस और चीनी संशोधनों की एक विस्तृत विविधता शामिल करने के लिए तैयार किया जा सकता है. इसके अलावा, oligos विशिष्ट nucleic एसिड परिवर्तन की नकल और इस प्रकार, महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा करने के लिए डीएनए नुकसान और मरम्मत के तंत्र के प्रभाव की जांच कर सकते हैं बनाया जा सकता है. हमने पाया है कि थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त 50 और 80 nucleotides के बीच एक लंबाई के साथ oligos विशेष रूप से अध्ययन करने के लिए उपयुक्त vivo में काम करता है, और गुणसूत्र आरएनए / डीएनए संकर के परिणामों में और डीएनए में एम्बेडेड ribonucleotides किया जा सकता है. / शाही सेना डीएनए संकर आसानी से डीएनए प्रतिकृति की मरम्मत, और प्रतिलेखन के दौरान फार्म कर सकते हैं, तथापि, कोशिकाओं में और किस हद तक इन संकर कोशिकाओं के आनुवंशिक अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं / शाही सेना डीएनए संकर की स्थिरता के बारे में बहुत कम जाना जाता है. Oligos शाही सेना से युक्त, इसलिए, एक परिपूर्ण गुणसूत्र डीएनए में ribonucleotides परिचय और शाही सेना डीएनए / संकर चुना लंबाई और आधार संरचना के उत्पन्न सदिश का प्रतिनिधित्व करते हैं. यहाँ हम यूकेरियोटिक मॉडल प्रणाली खमीर / Saccharomyces cerevisiae / के जीनोम में ribonucleotides के समावेश के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित थे . फिर भी, हमारी प्रयोगशाला का उपयोग किया गया है थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त oligos अलग सेल प्रणाली में गुणसूत्र के स्तर पर / शाही सेना डीएनए संकर उत्पन्न बैक्टीरिया से मानव कोशिकाओं के लिए.

Protocol

दलील

थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon oligos, 50 के 80-mers के लिए उपयोग का शोषण, यहाँ हम एक प्रक्रिया मौजूद एक जीन सुधार परख, जिसके द्वारा oligos खमीर कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए के आनुवंशिक जानकारी लक्षित गुणसूत्र डीएनए के लिए annealing निम्नलिखित हस्तांतरण कर सकते हैं पर आधारित है,. सफल oligos द्वारा लक्ष्यीकरण खमीर उम्मीद phenotype प्रदर्शित कालोनियों की उपस्थिति से रन बनाए है. यदि वांछित आनुवंशिक संशोधन oligo अनुक्रम में शामिल एक या एक से अधिक ribonucleotides के भीतर किया जाता है, आनुवंशिक जानकारी आरएनए पथ से सीधे गुणसूत्र लक्ष्य डीएनए, इस प्रकार, लक्ष्यीकरण प्रक्रिया के दौरान गुणसूत्र के स्तर पर / शाही सेना डीएनए संकर रूपों बहती है. ribonucleotide / थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त oligo एस जीन डीएनए की मरम्मत संश्लेषण के माध्यम से लक्ष्यीकरण के लिए टेम्पलेट के रूप में सेवा या डीएनए में एम्बेडेड हो सकता है हो सकता है और डीएनए प्रतिकृति के दौरान टेम्पलेट के रूप में सेवा. इन प्रयोगों में हम खमीर / Saccharomyces cerevisiae / यूकेरियोटिक मॉडल प्रणाली का उपयोग करें, तथापि, एक समान दृष्टिकोण भी अन्य जीवों या सेल प्रकार में लागू किया जा सकता सकता है. इस वीडियो में, हम एक लक्ष्य खमीर जीनोमिक ठिकाना के लिए एक थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon समरूपता के साथ डिजाइन oligo का उपयोग करें और बीच में एक ribonucleotide युक्त करने के लिए लक्ष्य जीन में उत्परिवर्तन सही. आरएनए युक्त oligo के साथ परिवर्तन के बाद, हम एक निश्चित आवृत्ति है, जो इंगित करता है कि oligo की शाही सेना पथ गुणसूत्र डीएनए में शामिल किया जा सकता है और डीएनए प्रतिकृति के दौरान डीएनए संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में में सेवा पर लक्षित साइट के सुधार निरीक्षण करते हैं. आनुवंशिक जानकारी आरएनए पथ के भीतर किए गए stably निम्नलिखित सेल पीढ़ियों के लिए फैलता है. यहाँ हम थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त oligo और दृष्टिकोण द्वारा खमीर सेल परिवर्तन के कदम गुणसूत्र डीएनए में शाही सेना हस्तांतरण जानकारी का पता लगाने का वर्णन.

शाही सेना - युक्त oligo ए डिजाइन इस प्रयोग में इस्तेमाल किया

हम एक शाही सेना से युक्त करने के लिए खमीर में एक आनुवंशिक दोष सही oligo डिजाइन किए हैं एस cerevisiae trp5 बिन्दुपथ में गुणसूत्र डीएनए. खमीर प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया तनाव में दो आधार विलोपन और एक बकवास उत्परिवर्तन (चित्रा 1 ए) के साथ एक उत्परिवर्ती जीन trp5 है. इस तरह के खमीर तनाव एक tryptophan auxotrophic उत्परिवर्ती है और tryptophan के बिना फार्म नहीं करता है मीडिया पर कालोनियों. TRP5 जीन के डीएनए अनुक्रम Saccharomyces जीनोम डाटाबेस (http://www.yeastgenome.org/) पर उपलब्ध है. थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता oligo 2 आधार डीएनए प्रविष्टि के साथ 65 पूर्व, विलोपन उत्परिवर्तन और एक के लिए trp5 एलील (चित्रा 1 ए) की बकवास उत्परिवर्तन सही डिजाइन ribonucleotide सही डिजाइन है. oligo के अनुक्रम के बाद के रूप में बनाया गया है:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG तटरक्षक GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. यह oligo 200 एनएम पैमाने पर थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon (Lafayette, सीओ) द्वारा संश्लेषित है, और desalted है, deprotected और PAGE शुद्धि के बिना इस्तेमाल किया.

खमीर परिवर्तन के लिए oligo शाही सेना युक्त (Storici एट अल से संशोधित, 2007 1) बी तैयार

  1. सामग्री है कि प्रयोग, oligo ट्यूब सहित pipettes, भंवर, रैक, प्रयोगात्मक क्षेत्र और RNase परिशोधन सब कुछ शुरू होने से पहले संभावित RNase संदूषण को निकालने के समाधान के साथ अन्वेषक द्वारा पहना दस्ताने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पोछो. RNase मुफ्त पानी, रासायनिक अभिकर्मकों, ट्यूब और सभी चरणों में विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करें. इस प्रयोग में हर कदम RNase मुक्त किया जाना चाहिए.
  2. Resuspend थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त oligo कंपनी से 250 pmoles / RNase मुफ्त पानी और सख्ती भंवर गोली भंग के साथ μl शेयर समाधान प्राप्त. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस
  3. तत्काल, परिवर्तन के पहले बर्फ पर oligo आरएनए युक्त पिघलना और 50 pmoles / μl RNase मुक्त RNase मुक्त ट्यूबों में पानी के साथ पतला. प्रत्येक परिवर्तन आरएनए युक्त oligos 1 nmole की आवश्यकता है.
  4. Oligos के माध्यमिक संरचनाओं को खत्म करने के लिए 2 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर शाही सेना युक्त oligos के एक चुना राशि denature.
  5. विकृतीकरण के तुरंत बाद बर्फ पर ट्यूब की जगह है. परिवर्तन तक बर्फ पर रखें.
  6. प्रयोग में नियंत्रण के रूप में एक इसी डीएनए केवल oligo प्रयोग किया जाता है. यह oligo -20 डिग्री सेल्सियस से thawed है और शाही सेना से युक्त oligo के रूप में परिवर्तन के लिए तैयार है, जैसा कि उपरोक्त वर्णित है.

सी. खमीर कोशिकाओं के परिवर्तन शाही सेना युक्त oligo का उपयोग

  1. Trp5 उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं के साथ अमीर YPD तरल माध्यम के 5 मिलीलीटर टीका लगाना और 30 डिग्री सेल्सियस रातोंरात देखने के (सामग्री) पर बढ़ने .
  2. YPD तरल माध्यम के 50 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति के 1.5 मिलीलीटर स्थानांतरण.
  3. 4 के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस हिलनेवाला (225 आरपीएम) में कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. 1 समाधान और समाधान 2 imm तैयारediately पहले RNase मुक्त ट्यूबों में परिवर्तन (सामग्री देखें).
  5. एक 50 मिलीलीटर RNase मुक्त ट्यूब और 3000 rpm, 2 मिनट के लिए 1562 ग्राम करने के लिए इसी, पर स्पिन के लिए सेल संस्कृति स्थानांतरण. सेल वर्षण की गोली लगभग है. 0.3 3 सेमी.
  6. RNase - मुक्त और 2 मिनट के लिए 3000 rpm पर पानी की स्पिन के 50 मिलीलीटर के साथ सतह पर तैरनेवाला और धोने कोशिकाओं निकालें.
  7. 5 बार के लिए चरण 6 दोहराएँ संस्कृति मध्यम और RNases है कि जितना संभव के रूप में में मध्यम में मौजूद हो सकता है छुटकारा.
  8. 1 समाधान और 2 मिनट के लिए 3000 rpm पर स्पिन के 5 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें.
  9. 1 समाधान के 250 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. कक्षों की यह राशि 7-8 परिवर्तनों के लिए पर्याप्त है.
  10. विभाज्य RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूबों में सेल निलंबन के 50 μl, 20 की μl जोड़ने आरएनए oligo काम कर (1 nmole) समाधान है, या केवल डीएनए oligo काम कर (1 nmole) समाधान है, या बाँझ पानी के 20 μl के 20 μl युक्त नकारात्मक नियंत्रण के लिए कोई oligo के साथ. तो प्रत्येक परिवर्तन की प्रतिक्रिया के लिए दो समाधान के 300 μl जोड़ें. Oligos अधिनियम के रूप में खुद को वाहक के रूप में कोई परिवर्तन की प्रक्रिया में सामन शुक्राणु डीएनए को जोड़ने की जरूरत है.
  11. भंवर सख्ती घटकों homogenously मिश्रण करने के लिए.
  12. ° 30 में एक प्रकार के बरतन में 30 मिनट के लिए सी परिवर्तन प्रतिक्रियाओं सेते हैं.
  13. पर 42 हीट सदमे ° सी 15 मिनट के लिए.
  14. 5000 आरपीएम, 4 मिनट के लिए 2236 ग्राम करने के लिए इसी, नीचे कोशिकाओं स्पिन.
  15. बाँझ पानी की 100 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें.
  16. इस सेल निलंबन की एक विभाज्य ले लो और यह बाँझ पानी के साथ 100.000 गुना और एक YPD लगभग का उपयोग कर की थाली पर थाली कोशिकाओं द्वारा पतला. 15 बाँझ ग्लास मनकों और 30 में सेते ° सी 2 दिनों के लिए.
  17. प्लेट सिंथेटिक tryptophan (अनुसूचित जाति - टीआरपी) लगभग का उपयोग कर के बिना पूरा ठोस माध्यम की एक पेट्री डिश पर प्रत्येक परिवर्तन की प्रतिक्रिया से सभी resuspended कोशिकाओं है. 15 बाँझ ग्लास मनकों और 30 में सेते ° सी के लिए 4-5 दिन (चित्रा 2).

डी. जीन सुधार के आरएनए युक्त oligo द्वारा विश्लेषण

  1. चयनात्मक मध्यम (चित्रा 2) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से YPD माध्यम पर हो कालोनियों आरएनए युक्त oligo के लिए जीन सुधार आवृत्ति की गणना करने के लिए, केवल डीएनए oligo और कोई oligo नियंत्रण के लिए संख्या की गणना. प्राप्त की संख्या की तुलना करें. दो आधार विलोपन और बकवास उत्परिवर्तन के साथ trp5 alleles की स्वतःस्फूर्त प्रत्यावर्तन दर प्रयुक्त खमीर तनाव में 10-9 से कम है, इस प्रकार हम चयनात्मक मध्यम जब कोई oligos कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं पर कोई कालोनियों गठन की उम्मीद है .
  2. कई बाहर स्ट्रीक YPD मध्यम पर बेतरतीब ढंग से उठाया transformant कालोनियों एकल कॉलोनी आइसोलेट्स प्राप्त. कॉलोनी के विकास के लिए दो दिन रुको, तो कई (कम से कम 5) एक कालोनियों ले और YPD और चयनात्मक माध्यम पर पैच.
  3. प्राइमरों की एक जोड़ी डिजाइन करने के लिए क्षेत्र (250-1,000 बीपी) कॉलोनी पीसीआर (चित्रा 1 बी) द्वारा oligo आरएनए युक्त द्वारा लक्षित बढ़ाना. पीसीआर कॉलोनी के लिए प्रक्रिया के रूप में निम्नानुसार (Storici और Resnick से संशोधित, 2006 2).
    1. Resuspend कोशिकाओं (1 mm3 लगभग) पानी की 50 μl में व्यक्तिगत पैच से लिया है और lyticase की एक इकाई जोड़ें. 10 मिनट, 100 पर एक गर्मी ब्लॉक में ऊष्मायन द्वारा बाद ° सी 5 से समाधान में और रिहाई के जीनोमिक डीएनए कोशिकाओं को तोड़ने मिनट के लिए. लिए कमरे के तापमान पर सेते
    2. पीसीआर स्थितियों: पीसीआर प्रतिक्रिया सेल resuspension के समाधान के 10 μl शामिल है, आगे और रिवर्स प्राइमरों के 50 प्रत्येक pmoles, 10 मिमी dNTPs, Taq पोलीमरेज़ की 1 यूनिट, 10x बफर और 5 μl 1 μl बाँझ पानी के साथ समायोजित किया जाता है 50 μl के अंतिम मात्रा. 95 पर 30 एस 30 चक्रों डिग्री सेल्सियस, 55 में 30 एस डिग्री सेल्सियस, और 72 में 1 मिनट डिग्री सेल्सियस;, 72 में 7 मिनट के अंतिम विस्तार समय डिग्री सेल्सियस, तो नमूने पीसीआर कार्यक्रम 3 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर है 4 में रखा डिग्री सेल्सियस 1 मिनट / केबी का एक विस्तार के समय इस प्रतिक्रिया के लिए माना जाता है.
    3. पीसीआर के बाद, नमूने एक 1% या 2% (पीसीआर उत्पाद की उम्मीद आकार पर निर्भर करता है) agarose जेल पीसीआर उत्पाद के अवलोकन के लिए (चित्रा 3) पर चलाए जा रहे हैं.
  4. यदि आनुवंशिक आरएनए युक्त oligo द्वारा हस्तांतरित जानकारी खमीर जीनोमिक लक्ष्य क्षेत्र में एक नए प्रतिबंध साइट (चित्रा 1 बी) उत्पन्न करता है, यह उचित प्रतिबंध एंजाइम के साथ पीसीआर उत्पाद पचाने के द्वारा सूचना के सही हस्तांतरण की पुष्टि करने के लिए संभव है. यदि कोई प्रतिबंध साइट आरएनए युक्त oligo द्वारा उत्पन्न होता है, तो चरण 6 पर जाएँ. डाइजेस्ट पीसीआर उत्पादों का उपयोग कर एक विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइम. पाचन प्रतिक्रिया पीसीआर उत्पाद, बफर, BSA (कुछ एंजाइमों के लिए इस्तेमाल एंजाइम के लिए निर्देश देखें जरूरत नहीं किया जा सकता है), 0.5 प्रतिबंध एंजाइम की μl 6 μl, और 15 μl बाँझ पानी भी शामिल है. नमूने इस्तेमाल एंजाइम के लिए विशिष्ट तापमान पर 1 घंटे के लिए incubated रहे हैं.
  5. एक पचाया नहीं नमूना एक 2% agarose जेल की एक ही पंक्ति के लिए आनुवंशिक संशोधन का पालन पर पचा नमूनों के साथ एक साथ चलाएँ ख का तबादलाy आरएनए युक्त oligo की शाही सेना पथ (चित्रा 3).
  6. पीसीआर पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके उत्पादों का शुद्ध और उन्हें डीएनए अनुक्रमण के लिए तैयार है. एक ही उत्पाद को बढ़ाना इस्तेमाल प्राइमरों के साथ अनुक्रमण के लिए नमूने जमा करें.
  7. डीएनए अनुक्रमण सॉफ्टवेयर है कि एक चुना संदर्भ अनुक्रम (चित्रा 4) के साथ एकाधिक दृश्यों के संरेखण की अनुमति देता है का उपयोग कर परिणाम का विश्लेषण.

ई. आरएनए युक्त oligo के क्षार सेवा (चित्रा 5)

  1. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक शाही सेना युक्त oligo, या डीएनए oligo nmole (250 pmoles / μl शेयर समाधान के 4 μl) जोड़ें.
  2. Hydrolysis के लिए एम 1 NaOH 4 μl जोड़ें, या वैकल्पिक रूप से नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 4 μl एच 2 हे जोड़ने के लिए, और एच. 1 के लिए 65 ° सी में एक पानी के स्नान में सेते फिर पानी के स्नान से बर्फ करने के लिए कदम.
  3. 1.2 एम एचसीएल, 1 एच 2 हे एम Tris - एचसीएल, और 4 μl के 4 μl, या वैकल्पिक रूप से एच 2 हे 6 μl और नकारात्मक नियंत्रण के लिए 4 1 एम Tris - एचसीएल के μl 2 μl के साथ बेअसर. परिवर्तन तक बर्फ पर रखें.

चित्रा 1
चित्रा 1. Trp5 दोषपूर्ण जीन की और TRP5 शाही सेना से युक्त oligo द्वारा सही एलील के योजनाबद्ध आरेख.) Trp5 उत्परिवर्ती जीन 2 आधार काले (त्रिकोण) विलोपन और एक आधार बकवास उत्परिवर्तन (तारांकन) शामिल हैं . एकल भूग्रस्त आरएनए युक्त oligo 2 आधार (नीला पाश) प्रविष्टि और 1-शाही सेना बेस (लाल आयत) प्रतिस्थापन एक Van91 प्रतिबंध मैं एंजाइम साइट (ब्रैकेट द्वारा दिखाया गया है) पैदा करने के साथ खमीर कोशिकाओं में तब्दील हो जाता है आनुवंशिक दोष को सही है trp5 जीन की. बी) के बाद TRP5 जीन आरएनए युक्त oligo (सही कुर्सियां ​​नीले आयत के रूप में संकेत कर रहे हैं) द्वारा ठीक है, Van91 मैं साइट TRP5 जीन में उत्पन्न होता है. केवल एक TRP5 जीन में Van91 मैं प्रतिबंध साइट सहित एक 278 बीपी टुकड़ा है पीसीआर प्राइमरों की एक जोड़ी (P1 और P2) द्वारा प्रवर्धित. 177 बीपी और 101 बीपी टुकड़े और Van91 द्वारा P2 पीसीआर उत्पाद P1 के पाचन के बाद उत्पन्न मैं भी दिखाए जाते हैं .

चित्रा 2
चित्रा 2. Oligo शाही सेना युक्त के साथ परिवर्तन के परिणामस्वरूप.) खमीर कोशिकाओं के साथ कोई oligo तब्दील किसी भी कॉलोनी को अनुसूचित जाति - टीआरपी मध्यम पर फार्म नहीं करते हैं , प्लेटें अब देखें. बी) प्लेट्स तटरक्षक शो खमीर कोशिकाओं के बाद अनुसूचित जाति टीआरपी पर बढ़ रही कालोनियों oligo शाही सेना युक्त के 1 nmole के साथ बदल रहे हैं. सी) प्लेट्स hl शो खमीर कोशिकाओं के बाद अनुसूचित जाति टीआरपी पर बढ़ रही कालोनियों इसी डीएनए केवल नियंत्रण oligo के 1 nmole के साथ बदल रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. आनुवंशिक जानकारी से हस्तांतरण की जांच आरएनए युक्त खमीर गुणसूत्र डीएनए पीसीआर उत्पाद के लक्षित जीनोमिक क्षेत्र. पीसीआर P1 और p2 से परिलक्षित और मैं Van91 प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा नमूनों की 2% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन amplifying प्रतिबंध पाचन द्वारा oligo . 1 लेन, 8 और 15, 100 के आकार, 200, 300, 400 और 500 बीपी के साथ डीएनए सीढ़ी बाईं तरफ संकेत, 2 लेन, trp5 trp5 उत्परिवर्ती तनाव के जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित बिन्दुपथ की पीसीआर उत्पाद, 3 लेन, पीसीआर उत्पाद टीआरपी + डीएनए केवल oligo द्वारा लक्षित कॉलोनी से निकाली गई जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित, 9 से 14 लेन, Van91 मैं प्रतिबंध पाचन, 4-7 लेन, पीसीआर उत्पादों टीआरपी आरएनए युक्त oligo द्वारा लक्षित + कालोनियों से व्युत्पन्न जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित 2 से 7 गलियों से पीसीआर उत्पादों की. बिना खतना के 10 से 14 गलियों में पीसीआर उत्पाद बैंड की उपस्थिति Van91 मैं आंशिक पाचन द्वारा TRP5 ठिकाना (CCACATTCTGG) पर समझाया जा सकता है. यह देखते हुए कि Van91 मैं (CCANNNN NTGG) के लिए काटने साइट में एकाधिक दृश्यों हो सकता है, TRP5 में उत्पन्न साइट एंजाइम के लिए सबसे इष्टतम लक्ष्य नहीं हो सकता. वास्तव में, के बाद सब से ऊपर पीसीआर उत्पादों के डीएनए अनुक्रमण हम oligos द्वारा किया जाता (चित्रा 4 देखें) उन से परे कोई अतिरिक्त परिवर्तन का पता लगाने. 278 बीपी पीसीआर Van91 द्वारा P1 और P2 प्राइमरों और पाचन उत्पाद बैंड द्वारा प्रवर्धित बैंड मैं 177 बीपी और 101 बीपी के दाईं तरफ तीर द्वारा दिखाया जाता है .

चित्रा 4Thumb
चित्रा 4. डीएनए अनुक्रमण आरएनए युक्त oligo द्वारा जीन सुधार दिखा परिणाम है. ए) जीनोमिक क्षेत्र के डीएनए electropherogram आरएनए युक्त oligo द्वारा लक्षित है . डीएनए अनुक्रम (नीला बॉक्सिंग) में जी आरएनए युक्त oligo पर आरजी से निकला. इसके अलावा बॉक्सिंग तटरक्षक अड्डों में से एक प्रविष्टि है. अन्य सभी पीसीआर उत्पादों से अनुक्रमण परिणाम भी पृष्ठभूमि अच्छी तरह से ऊपर फ्लोरोसेंट संकेत के साथ, के रूप में यह एक के रूप में स्पष्ट है. बी) टीआरपी + transfo के TRP5 क्षेत्र के अनुक्रमद्वारा लक्षित केवल डीएनए (T1) oligo और आरएनए युक्त oligo (T2-T5) शीर्ष पर आम सहमति अनुक्रम में मैच और rmants trp5 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के साथ कि पहले oligos द्वारा लक्ष्यीकरण (जीनोमिक डीएनए, लाल तुलना कर रहे हैं छायांकित). मरम्मत आरएनए युक्त तल पर oligo दो आधार डीएनए प्रविष्टि और (G) एक आधार आरएनए प्रतिस्थापन लाल रंग में चिह्नित है. में बॉक्सिंग क्षेत्रों पीला छाया दिखाने के साथ नीले रंग की है कि शाही सेना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से oligo युक्त डीएनए केवल oligo ठीक विलोपन उत्परिवर्तन और सभी परीक्षण के नमूने में बकवास उत्परिवर्तन सही. धराशायी लाइनों आरएनए युक्त oligo अनुक्रम की स्थिति निशान. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 4 का एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 5
चित्रा 5. क्षार उपचार शाही सेना युक्त oligo द्वारा जीन सुधार रोकता आरएनए युक्त oligo (नि.) द्वारा परिवर्तन आवृत्ति लाल और नीले सलाखों में केवल डीएनए oligo (डी) द्वारा दिखाया गया है कि बार में दिखाया गया है.. त्रुटि सलाखों के प्रत्येक oligo के लिए 3 स्वतंत्र परिवर्तनों के लिए यह मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. केवल डीएनए oligo NaOH उपचार के बिना और उसके साथ भी इसी तरह का परिवर्तन आवृत्ति प्रदर्शित करता है. अलग है, शाही सेना युक्त oligo द्वारा परिवर्तन आवृत्ति 0 NaOH के साथ इलाज के बाद चला जाता है. इसलिए, oligo शाही सेना युक्त के साथ तैयार डीएनए केवल oligo साथ दूषित नहीं है, इस प्रकार, मनाया परिवर्तन आवृत्ति आरएनए युक्त oligo विशिष्ट है.

Discussion

तथ्य यह है कि शाही सेना आनुवंशिक जानकारी सीधे कक्षों में कर सकते हैं हस्तांतरण जीनोमिक डीएनए सिंथेटिक शाही सेना युक्त oligos का उपयोग (Dharmacon संश्लेषित oligos) 1 शोषण की खोज की थी. यह सिद्धांत का सबूत है कि कोशिकाओं के डीएनए संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में शाही सेना अणु युक्त या शाही सेना केवल दृश्यों का उपयोग कर सकते हैं था. उपयोग शाही सेना युक्त प्रदर्शन करने के लिए न केवल नेतृत्व oligos कि शाही सेना से आनुवांशिक जानकारी सीधे स्थानांतरित कर सकते जीनोमिक डीएनए के लिए एक रिवर्स लिखित डीएनए प्रतिलिपि मध्यवर्ती की जरूरत के बिना, लेकिन यह भी सबूत है कि शाही सेना में मुताबिक़ टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक 1,3 डीएनए क्षति की मरम्मत. oligos आरएनए ही बनाया जा सकता है या सिर्फ एक ही एक डीएनए अनुक्रम में एम्बेडेड ribonucleotide होते, उदाहरण के रूप में हम यहाँ प्रस्तुत है. आरएनए युक्त oligo एक एम्बेडेड जीनोमिक दोषपूर्ण एलील trp5 में बकवास उत्परिवर्तन सही डिजाइन ribonucleotide है. ribonucleotide से जीनोमिक डीएनए आनुवंशिक जानकारी के हस्तांतरण phenotype लक्षित कोशिकाओं (सेल tryptophan की कमी मध्यम पर बढ़ती) में एक बदलाव से पता चला है. जीन oligo शाही सेना युक्त के साथ प्राप्त सुधार की आवृत्ति मापा और यह है कि एक नियंत्रण डीएनए केवल oligo के साथ तुलना. अलग सेल पृष्ठभूमि, जहां हम विभिन्न खमीर जीन रूप बदलना में इस जीन सुधार परख प्रदर्शन करके, हम पता लगा सकते हैं जो कारक / एस विशेष रूप से शाही सेना युक्त oligos द्वारा लक्ष्यीकरण प्रभावित. इस प्रकार, हम कैसे कोशिकाओं / शाही सेना डीएनए संकर की स्थिरता को विनियमित तंत्र प्रकट कर सकते हैं. बस आरएनए युक्त oligos के विभिन्न वेरिएंट डिजाइन करके हम एक विशेष शाही सेना डीएनए में संशोधन टेम्पलेट के रूप में सेवा पथ के लिए संभावना का निर्धारण और हम विशिष्ट शाही सेना डीएनए में एम्बेडेड अनुक्रम की स्थिरता को निर्धारित कर सकते हैं कर सकते हैं. इसके अलावा, हम की पहचान कर सकते हैं शाही सेना डीएनए / संकर के साथ बातचीत करने वाले कारकों के लिए vivo substrates में क्या पसंद कर रहे हैं.

जबकि इन विट्रो अध्ययन में कई, मुख्य रूप से कम उपयोग शाही सेना युक्त oligos, कारकों है कि एक संकर में डीएनए के साथ शाही सेना को पहचान सकते हैं, जैसे RNase एच 4 एंजाइमों RNases एच के vivo कार्यों में के रूप में अच्छी तरह के समारोह विशेषताएँ आयोजित किया गया है अन्य प्रोटीन है कि प्रभावित हो सकता है / शाही सेना डीएनए संकर स्थिरता ज्यादातर अनजान रहते हैं की पहचान के रूप में. संभावना का उपयोग करने के आरएनए युक्त एक महत्वपूर्ण (50 से 80 mers) लंबाई और इष्टतम गुणवत्ता के oligos (जैसे थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon आरएनए युक्त oligos) में vivo में सीधे आणविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए रास्ता खुला है ब्याज की कोशिकाओं. जैसा कि इस वीडियो, परिवर्तन में दिखाया का उपयोग शाही सेना युक्त oligos अनिवार्य रूप से केवल डीएनए अणु का उपयोग RNases से गिरावट को रोकने के परिवर्तन की तुलना में कुछ अतिरिक्त कदम की आवश्यकता है. इस प्रकार, परिवर्तन आरएनए युक्त oligos खमीर प्रणाली के लिए सीमित नहीं है, लेकिन का उपयोग कर किसी भी जीव या कोशिका प्रकार है जहां डीएनए oligos द्वारा परिवर्तन कुशल है करने के लिए लागू किया जा सकता है.

अंत में, द्वारा कोशिकाओं को लक्षित शाही सेना युक्त oligos आरएनए / डीएनए संकर और ribonucleotides कक्षों में vivo में डीएनए में एम्बेडेड उत्पन्न करने का अवसर प्रदान करता है. स्थिरता, समारोह और vivo में इन के परिणामों आरएनए उत्पन्न / डीएनए संकर और विश्लेषण किया जा सकता है विशेषता है, संभावित डीएनए की मरम्मत के अज्ञात तंत्र uncovering और लक्ष्यीकरण जीन के लिए उपन्यास रणनीतियों का खुलासा.

Disclosures

इस अनुच्छेद के लिए वीडियो उत्पादन थर्मो फिशर साइंटिफिक, जो अभिकर्मकों और इस प्रकाशन में उपयोग किए गए साधन पैदा द्वारा प्रायोजित किया गया था.

Acknowledgments

यह काम जॉर्जिया कैंसर गठबंधन अनुदान R9028 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

A. Transformation reagents and media (modified from Storici and Resnick, 2006

  1. YPD (Yeast Peptone Dextrose): For 1 L, 10 g yeast extract, 20 g soy peptone, 20 g dextrose. Add 15 g agar to make YPD solid media. Autoclave before use. Store at room temperature.
  2. Solution 1: 0.1 M of lithium acetate. Prepare immediately before transformation. Solution 1 is a working solution, thus it is prepared directly from the powder. No stock solution is made. Keep at room temperature. LiAc increases the yeast cell wall permeability to DNA.
  3. Solution 2: 0.1 M of lithium acetate and 50 % of polyethylene glycol 4000. Also solution 2 is a working solution and it is made directly from the powder. No stock solution is prepared. Keep at room temperature. PEG deposits oligos onto yeast cells.
  4. RNA-containing oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalted, deprotected and non-purified. Resuspend to 250 pmoles/μl. Store at -80 °C.
  5. DNA-only oligos, 50-80-mers, desalted and non-purified. Resuspend to 50 pmoles/μl. Store at -20 °C.
  6. SC-Trp (Synthetic complete media lacking tryptophan) solid media.
  7. 0.5 cm diameter glass beads, sterilized by autoclaving.
  8. RNase-off: RNase decontamination solution.
  9. DNase/RNase-free, sterile centrifuge tubes.
  10. DNase/RNase-free, sterile conical tubes.
  11. DNase/RNase-free, sterile aerosol pipette tips with ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml.

B. Colony PCR materials.

  1. DNA primers, desalted and non-purified. Dissolve in sterile water to 50 pmoles/μl. Store at -20 °C.
  2. Taq DNA polymerase, buffer, dNTPs.
  3. PCR tubes.

C. PCR purification.

  1. PCR purification kit.

D. Gel Electrophoresis.

  1. Agarose.
  2. 1 x TBE running buffer (45 mM Tris-borate and 1 mM ethylenediamine tetraacetate) diluted from 10x TBE.
  3. Prestained molecular weight marker.
  4. DNA loading dye.

E. Restriction digestion.

  1. Restriction enzymes, 10x buffers, BSA.

F. Alkali treatment for the RNA-containing oligo.

  1. 1 M of NaOH solution.
  2. 1.2 M of HCl solution.
  3. 1 M of Tris-HCl, pH 7.4 solution.

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References

  1. Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. RNA-templated DNA repair. Nature. 447, 338-3341 (2007).
  2. Storici, F., Resnick, M. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).
  3. Storici, F. RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair. Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).
  4. Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes. FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).
जीनोमिक डीएनए / आरएनए और डीएनए संकर की शाही सेना युक्त परिवर्तन का उपयोग कर oligonucleotides द्वारा जनरेशन
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Shen, Y., Storici, F. Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (45), e2152, doi:10.3791/2152 (2010).More

Shen, Y., Storici, F. Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (45), e2152, doi:10.3791/2152 (2010).

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