Summary
في هذه المقالة ، نقدم منهجية بسيطة لتمكين طويل الأجل
Abstract
فهم العلاقة بين العوامل الوراثية وmicroenvironmental التي تدفع التطور الجنيني الطبيعي وتالف أمر أساسي لاكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة. وقد مكنت التطورات في تكنولوجيا التصوير التحقيق الكمي للتنظيم وإنضاج خطة الجسم ، ولكن التشكل الجنيني مرحلة لاحقة أقل وضوحا. أجنة الدجاج وحيوان فقاري جاذبية النظام النموذجي لهذا التطبيق بسبب سهولة التلاعب الثقافة والجراحية. يمكن تربيتها الأجنة المبكرة لفترة قصيرة على ورقة حلقات التصفية ، التي تمكن من الوصول الكامل لالزخرفة الضوئية الخلية ومصير 1،2 الدراسات. تتم تقليديا دراسة العمليات التنموية المتقدمة مثل التشكل القلب من خلال نافذة من قشر البيض 3-5 ، لكن هذه التقنية البصرية حدود الوصول تبعا لحجم النافذة. ونحن سبق وضعها طريقة بسيطة لثقافة بأكملها الأجنة السابقين البيضة على قوارب تزن سداسية لمدة تصل إلى 10 يوما ، مما مكن ارتفاع القرار التصوير بالموجات فوق الصوتية عبر 6،7. وكانت هذه الثقافات من الصعب النقل ، والحد من أنواع الأدوات المتاحة للتجارب التصوير الحي. نقدم هنا هو تحسين نظام الثقافة قذيفة أقل مع دائرة فعالة من حيث التكلفة والبيئية المحمولة. وضبطت البيض على أرجوحة إنشاؤها بواسطة الغشاء البولي يوريثين (تتشبث التفاف) الملصقة circumferentially الى كوب من البلاستيك مملوءة جزئيا بالماء المعقم. وكانت أبعاد محيط وعمق أرجوحة الحرجة على حد سواء للحفاظ على التوتر السطحي ، في حين أن ميكانيكا أرجوحة والمياه تحت ساعد تخفيف الاهتزازات الناجمة عن النقل. وقد وضعت أيضا بصمة صغيرة تعميم حمام مائي لتمكين استمرار التحكم في درجة الحرارة خلال التجريب. علينا أن نظهر القدرة على الأجنة الثقافة في هذا الطريق لمدة 14 يوما على الأقل من دون عيب أو تأخير morphogenic وتوظيف هذا النظام في عدة المجهرية وتطبيقات التصوير.
Protocol
1 بروتوكول الثقافة السابق البيضة :
- يحضن بيض الدجاج المخصب
- ويمكن تخزين بيض الدجاج المخصب بنسبة 13 درجة مئوية تصل إلى 5 أيام قبل الشروع في الحضانة دون التنمية. ويمكن للبرودة النبيذ الأحمر الحفاظ على درجة الحرارة هذه.
- احتضان البيض الجانب حادة حتى في حاضنة رطوبة ثابتة مع 60 ٪ في التأرجح المستمر 37.5 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
- إعداد الأراجيح (الشكل 1A)
- ملء ¾ 9 أكواب البلاستيك أوقية مع الماء المعقم الدافئ. ألف أوقية العادية 9 الكأس التي يبلغ قطرها 8 سم من الأعلى. وجدنا أن هذا الحجم هو الأنسب لتطبيق وقت طويل الثقافة المعروضة هنا.
- قطع حوالي 20 سم تتشبث التفاف. circumferentially يضعوا على رأس الكأس بوضع الشريط المطاطي حولها. وينبغي نشر من البلاستيك على سطح الماء. قطع البلاستيك الزائد حول الفرقة. وجدنا تتشبث التفاف إلى أن تكون أكثر ملائمة لهذا التطبيق لأنه يمنع التصاق من صفار البيض ، مما أدى إلى تقسيم صفار أثناء النقل.
- مسح البلاستيك مع kimwipes (كيمبرلي كلارك ، وشركة) المبللة مع الايثانول 70 ٪.
- إزالة البيض من الحاضنة بعد 72 ساعة من الحضانة.
- تعقيم البيض بنسبة مسح السطح مع kimwipes الايثانول 70 ٪ المبللة.
- وضع البيض أفقيا لمدة 1-2 دقائق لتحديد الموقع الصحيح للجنين (الشكل 1B). يمكن استخدام كرتون البيض لوضع البيض أفقيا. وتناوب الأجنة إلى الأعلى بعد 1-2 دقائق.
- نقل الأجنة على الأراجيح في جو معقم و مطهر الصفحي هود التدفق.
- باستخدام حافة حادة (مثل حافة دلو معدني أو كوب زجاج) ، انقر فوق البيض برفق حتى يكون هناك عراقيل صغيرة على الجانب السفلي من البيض (الشكل 1C). تذكر ، يتم وضع الجنين على upperside.
- وضع الابهام في طرفي نقيض من دنت وسحب قذائف أفقيا بعيدا (1D الشكل).
- صفار مع وضع الجنين ، وكذلك على الألبومين في أرجوحة (الشكل 1E). وسوف توفر بيئة الألبومين الملطف حول صفار البيض لامتصاص الصدمات الناجمة عن الانتقال للنظام فضلا عن أنها توفر التغذية إلى الجنين للممارسات الثقافة طويلة. والمياه تحت أرجوحة ضمان جنين ستبقى موازية على الأرض أثناء النقل ، ويكون بمثابة موصل للحرارة أثناء التصوير إذا تم استخدام سخان المياه تداول.
- وينبغي بالفعل أن الجنين يكون وضع على أعلى إذا تم تنفيذ نقل بشكل صحيح. إذا لم يكن كذلك ، استخدام unsharp ، وجوه العقيمة (غيض من مقص بلانت أي. المنحنية المغلقة) ويداعب إتجاهي صفار بحيث يدور الجنين إلى الأعلى.
- مكان قطره 10 سم طبق بتري على رأس الكأس لختم الجنين.
- ثقافة مكان الكأس في مجموعة حاضنة في 37.5 درجة مئوية. إذا تم استخدام حاضنة المحمولة ، ووضع سبتمبر 1-2 أكواب أوقية مملوءة بالماء المقطر تحافظ على الرطوبة في ~ 60 ٪ (الشكل 1F).
- إذا زرع الأجنة بعد اليوم 7 الجنينية ، ينبغي تناثرت قطع قشر البيض سحق حول محيط جنين كمصدر للكالسيوم العظام وتطوير النضج.
التبعي للمعدات التصوير خارج الحاضنة / التلاعب :
بنيت حمام ماء المتداولة في المنزل للحفاظ على درجة حرارة الحضانة بينما التصوير أو تلاعب (الشكل 3). تم توصيل مياه الحمام التي يمكن أن تناسب الكأس عبر أنابيب الحجم المناسب إلى خزان المياه. ألف سخان المقاومة بتسخين المياه في الخزان الذي ينظم يدويا باتباع درجة حرارة الماء. مضخة مياه توزع الماء. التمثيل Pictoral يصور سهولة التصوير عبر ultrasongraphy / florescent المجهري (الشكل 3).
الشكل 1. أرجوحة إعداد ونقل أجنة الدجاج إلى الأراجيح.
الشكل 2. يمكن زراعة أجنة الدجاج مرحلة مختلفة نمت عبر تقنية السابقين الثقافة البيضة الجنين اعتبارا من 17 سمو عبر هذه التقنية -- نتائج ممثل.
الشكل 3. التخطيطي وممثل الصور من المياه المستخدمة في نظام التداول بالتزامن مع النظام السابق للثقافة البيضة للحفاظ على الأجنة في درجة حرارة مثالية التنمية.
2. تطبيقات مختارة :
أولا Microinjection
هذه الثقافة الجنين هو مناسبة لتطبيقات الحلول microinjection حيث يجب أن يتم حقنه إلى الأوعية الدموية للتصوير التباين القائمة (أي. المجهري فلوري ، الصغيرة المحسوبة الطوبوغرافيا الخ) (الشكل 4). أقل من بروتوكول microinjection :
- إعداد appara الحقنطوس
- سحبت أزياء 0.75 أنابيب زجاجية معرف الشعرية في microneedles مشطوف الحافة باستخدام microforge. حجم رأس المطلوبة يتوقف على المعدل المستهدف قطرها / تدفق الوريد المطلوب.
- الاتصال المحقنة إلى 0.03 بوصة معرف أنابيب السيليكون.
- تحميل الأنابيب مع الحل ليتم حقنه وتوصيلها إلى microneedle الأنبوب.
- ضع microneedle على لmicromanipulator والمحاقن لحاملها حقنة أو مضخة الحقنة.
- إضافة الماء المعقم في رفع الكأس وبالتالي الجنين. عانينا لاختراق تلك المناسبة من الإبرة في وعاء دموي (أي محي السفينة) ، ومعدل انتشار الأفقي ضروري. هذا يتطلب أن يكون الجنين على متن الطائرة نفسها على حواف الكأس.
- إخراج الشريط المطاطي عقد بلاستيكية تحت الجنين.
- رفع جانب واحد من البلاستيك بلطف وإضافة بعض الماء المعقم في الكأس.
- تأمين الشريط المطاطي على البلاستيك مرة أخرى.
- حقن حل لسفينة الجنينية. في تجربتنا ، وعندما يتم حقن حل لسفينة المحية ، microneedles الحجم يحتاج إلى عشر ما يقرب من 1 / 10 من اوعية للحفاظ على كفاءة الارواء دون التسبب في حدوث نزيف.
- مضخة حل microneedle ضمان عدم تشكيل فقاعات الهواء.
- محاذاة غيض من microneedle على السفينة المختارة. بالنسبة للسفن المحية ، اختيار منطقة الشوكة تعطي المساحة القصوى لاختراق سفينة.
- دفع الإبرة في اتجاه السفينة. وسوف يتراجع السفينة الأولى. بمجرد أن تخترق إبرة ، بدء الارواء. وينبغي أن لون الدم المتدفق مع تغيير الارواء. إذا لم يتم تغيير لون المشاهدة ، قد اخترقت إبرة من السفينة. في هذه الحالة ، يتراجع ببطء في حين ضخ microneedle في وقت واحد حتى حل فانه ينظر الى تغير اللون في السفينة. بمجرد اكتمال التروية ، التراجع عن microneedle من السفينة.
الشكل 4 : Microinjection صبغة الفلورسنت في الأوعية الدموية للجنين البيضة فرخ السابقين مثقف.
II. الإجراءات المجهرية -- ربط الأذيني الأيسر
هذا الإعداد الثقافة السابقين البيضة مثالية لأداء التطبيقات جراحية لافراخ الدجاج نظرا لأنه يتيح الوصول الكامل إلى الجنين. غادر ربط الأذيني (LAL) (الشكل 5) هي أقل من بروتوكول للتقنية سبيل المثال ،. يتم تنفيذ هذا الإجراء حوالي 24 ساعة في الفترة الثقافة (HH24) :
- تعد الذراع عقدة ~ 0.5 مم باستخدام النايلون 10-0 خياطة جراحية.
- ملقط مع غرامة ، وإزالة محليا الأغشية المشيمية والسقاء على الجنين ورفع الجنين من الجزء الخلفي للتدوير مثل ذلك عموديا أن الجانب الأيسر من الجنين غير مرئية.
- باستخدام الملقط غرامة ، وإزالة تأمور عبر الأذين الأيسر.
- محاذاة عقدة على الأذين الأيسر واربطه بإحكام. وينبغي عقد قرانه وذلك لمنع ~ 75 ٪ من تدفق الدم الأصلي إلى الجانب الأيسر. قطع حواف عقدة مع microscissors وإزالة بعناية وتجاهل الدرز الزائدة.
- تدوير الجنين مرة أخرى إلى التوجه الأصلي (على الجانب الأيمن العلوي).
- وسوف تشمل الضوابط صورية نفس الإجراء ولكن لن يكون مجرد خياطة مرت ، وتعادل لا. سيتم تأكيد المعاملة LAL فعالة (75 ٪ انقباض) في 24 ساعة بعد الجراحة ، وسيتم استبعاد الأجنة تنحيته.
الشكل 5 : عنصر تحكم واليسار الأذيني الجنين الفرخ ligated سهم يظهر الأذين الأيسر ، الذي يبعد نحو 75 ٪ في الجنين أصغر ligated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الوصول البصرية والتجريب في أجنة الطيور يمثل تحديا بسبب القيود التي تفرضها على قشرة البيضة. النوافذ يحد بشكل كبير من عدد من microvessels الوصول للنهج الحقن والمجهرية 8. ويمكن نتيجة لذلك يمكن معالجته إلا الأجنة المبكر والمراقبة المستمرة غير ممكن. وكانت أوائل السابقين البيضة الثقافات باستخدام أطباق بتري استخدام محدود بسبب عدم كفاية الرقابة من التوتر السطحي على الجنين منعت الثقافة المدى الطويل 9. نحن تحسنت مؤخرا باستخدام هذه التقنية سداسية وزن الزورق الذي يحافظ على سطح مقبولة tenstion 7 ، ولكن هذه الثقافات كان من الصعب النقل. تقنية المعروضة هنا لا يحل هذه المشكلة ويوسع بشكل كبير على نوع من أساليب وتقنيات التصوير التجريبية التي يمكن استخدامها بما في ذلك الإجراءات microinjection والجراحية. كما تركز البحوث على فهم الأحداث morphogenic في وقت لاحق ، وسوف تمكن هذه التقنية للرصد والتشكيل للأحداث التنمية التي هي حاليا المستحيل لدراسة التجربة بشكل مستمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
