Summary
В этой статье мы приведем простой методологии чтобы долгосрочные
Abstract
Понимание связи между генетическими и микросреды факторы, влияющие на нормальное и неправильного эмбрионального развития имеет основополагающее значение для открытия новых терапевтических стратегий. Достижения в области технологий визуализации позволили количественного исследования организации и созревание тела план, но поздней стадии эмбрионального морфогенеза менее ясна. Куриные эмбрионы привлекательным позвоночных животных модельной системы для такого применения из-за своей простоты культуры и хирургических манипуляций. Ранние эмбрионы могут быть культивировали в течение короткого времени на фильтровальную бумагу кольца, которое позволяет полностью оптического доступа для структурирования клетки и 1,2 судьба исследований. Изучение передовых процессов развития, таких как сердечный морфогенез традиционно осуществляется через окно яичной скорлупы 3-5, но эта техника пределы оптического доступа за счет размера окна. Ранее мы разработали простой метод культуры целых зародышей экс-ово с шестиугольными вес лодки на срок до 10 дней, что позволило высоким разрешением с помощью УЗИ 6,7. Эти культуры были трудно транспортировать, ограничивающий типы изображений инструментов, доступных для живых экспериментов. Мы здесь присутствует улучшенный оболочки менее культуре системы с экономически эффективной, портативные экологической палаты. Яйца были трещины на гамак создан полиуретановой мембраны (цепляются обертка), наложенных на окружности пластиковый стаканчик, частично заполненной стерильной водой. Размеры окружности и глубину гамак оба были важны для поддержания поверхностного натяжения, в то время как механика гамак и воды под помогли ослабить колебания индуцированного транспорта. Небольшой размер оборотной водой ванне был также разработан, с тем постоянный контроль температуры во время экспериментов. Мы демонстрируем способность к культуре эмбрионов на этом пути, по крайней мере 14 дней без морфогенный дефект или отложить и использовать эту систему в нескольких микрохирургических и визуализации приложений.
Protocol
1. Ex-ово культуры Протокола:
- Инкубируйте оплодотворенных куриных яиц
- Оплодотворенные яйца куриные можно хранить при температуре 13 ° С до 5 дней до начала инкубации без развития. Красный кулер вино может поддерживать эту температуру.
- Инкубировать яйца тупой стороной в 60% постоянная влажность инкубатора с непрерывным качалки на 37,5 ° С в течение 72 часов.
- Подготовка гамаки (рис. 1а)
- Заполните ¾ от 9 чашек унции пластика с теплой стерильной водой. Регулярные 9 унций чашка имеет верхнюю диаметром 8 см. Мы обнаружили, что этот размер был наиболее подходящим для длительного применения культуры времени, представленные здесь.
- Отрежьте около 20 см цепляются обертка. Прикрепите окружности в верхней части чашки, поставив резинкой вокруг. Пластиковые должна быть распространена на поверхности воды. Сокращение избыточных пластиковых вокруг группы. Мы обнаружили, цепляются обертка, наиболее подходящий для данного применения, так как он предотвращает адгезию желток, в результате расщепления желтка во время транспортировки.
- Протрите пластика с kimwipes (Kimberly-Clark, Inc), смоченным 70% этанола.
- Удалить яйца из инкубатора после 72 часов инкубации.
- Стерилизовать яйца, протерев поверхность с 70% этанола смоченный kimwipes.
- Положите яйца горизонтально в течение 1-2 минут для правильного позиционирования эмбриона (рис. 1b). Яйцо картона могут быть использованы для откладки яиц по горизонтали. Эмбрионы будут вращаться в начало через 1-2 минут.
- Трансфер эмбрионов на гамаки асептически в ламинарном боксе.
- Используя острый край (например, край ведра металла или стеклянный стакан), нажмите яйцо осторожно, пока не будет небольшая вмятина на нижней стороне яйца (рис. 1в). Помните, что эмбрион расположен на upperside.
- Большие пальцы рук в противоположные стороны вмятины и потяните оболочек, кроме горизонтально (рис. 1г).
- Место желток с эмбрионом, а также альбумина на гамак (рис. 1д). Альбумин обеспечит увлажнения окружающей среды вокруг желтка потрясениям индуцированного движением системы, а также обеспечивает питание для эмбриона долго практики культуры. Вода под гамак обеспечит эмбрион будет находиться параллельно земле во время транспортировки и служить проводником тепла во время съемки, если водонагреватель обращения используется.
- Эмбрион уже должны быть расположены на вершине, если перевод осуществляется должным образом. Если нет, используйте нерезкого, стерильный объект (то есть, Блант кончика закрытой изогнутые ножницы) и направленно ласкать желток, что эмбрион поворачивается к вершине.
- Место 10 см диаметра чашки Петри на вершине чашки, чтобы запечатать эмбриона.
- Место чашку культуры в термостат при 37,5 ° C. Если портативный инкубатор используется, размещение 1-2 9 унций чашки с дистиллированной водой сохраняет влажность ~ 60% (рис. 1е).
- Если культивирование эмбрионов за пределы эмбрионального день 7, измельченные части яичная скорлупа должна быть разбросаны по периферии эмбриона, как источник кальция для развития костей и созревания.
Вспомогательное оборудование за пределами инкубатора изображения / манипуляции:
Циркулирующих водяной бане была построена в доме для поддержания температуры инкубации в то время как изображения или манипуляции (рис. 3). Водяную баню, что может поместиться чашку подключен через соответствующие трубки размером водохранилище. Сопротивление нагреватель нагревает воду в резервуаре, который регулируется вручную, выполнив следующие температуры воды. Водяного насоса циркулирует вода. Pictoral представление изображает визуализации простота через ultrasongraphy / florescent микроскопии (рис. 3).
Рисунок 1. Подготовка гамак и передачи куриных эмбрионов для гамаков.
Рисунок 2. Представитель результаты -. Разной стадии куриные эмбрионы выращивают через бывшие ово техники культуры Эмбрионы от HH 17 года могут быть выращены с помощью этой техники.
Рисунок 3. Схема и представитель фотографии системе циркуляции воды используется в сочетании с экс-ово культуре системы, которая обеспечит эмбрионов при идеальной температуре развития.
2. Выбранный применения:
И. Микроинъекция
Это культивирования эмбрионов подходит для приложений, где микроинъекции решения должны быть введены в сосудистой для контраста основан томография (т.е. флуоресцентной микроскопии, микро-вычисляется топография и т.д.) (рис. 4). Ниже микроинъекции протокола:
- Подготовка инъекций аппаратурыТус
- Мода вытащил 0,75 ID стеклянные капилляры в скошенным кончиком использованием микроигл microforge. Размер наконечника необходимо зависит от целевой вены диаметром / расход лучшего.
- Подключите шприц 0,03 дюйма трубки силиконовые ID.
- Нагрузка труб с решением для инъекций и подключить микроиглы для труб.
- Место микроиглы на микроманипулятора и шприцев для держателя шприца или шприц насос.
- Добавить стерильной воды в чаше тем самым повышаете эмбриона. Мы испытали, что для правильного проникновения иглы в кровеносный сосуд (т.е. судна желточной), горизонтальная проникновения необходимо. Это требует эмбриона, чтобы быть на той же плоскости, края чашки.
- Возьмите резиновую ленту проведения пластмасс под эмбриона.
- Поднимите одну сторону пластиковой мягко и добавьте немного стерильной воды для чашки.
- Закрепите резинкой на пластиковые снова.
- Inject решение эмбриональных сосудов. По нашему опыту, когда решение вводится в сосуд желточной, микроигл должны быть размером примерно 1 / 10-го диаметра сосуда для поддержания эффективной перфузии, не вызывая кровотечения.
- Насос решение микроиглы гарантируя, что ни образование воздушных пузырьков.
- Совместите кончик микроиглы на выбранном судне. Для судов, желточной, выбирая вилкой области даст максимальную площадь проникнуть в судно.
- Нажмите иглы к емкости. Судно сначала убирается. Как только игла проникает, начала перфузии. Цвет течет кровь должна измениться с перфузии. Если изменения цвета не видели, игла может проникли из сосуда. В этом случае, медленно отведите микроиглы одновременно насосных решение до изменения цвета в сосуде не наблюдается. После перфузии завершения отказаться микроиглы из сосуда.
Рисунок 4: микроинъекции флуоресцентного красителя в сосудистую из экс-ово культурный куриного эмбриона.
II. Микрохирургическая Процедура - левого предсердия Лигирование
Это экс-ово культуры установка идеально подходит для проведения хирургических приложений куриных эмбрионов, поскольку она обеспечивает полный доступ к эмбриону. Ниже приводится протокол для примера технику, левого предсердия перевязки (LAL) (рис. 5). Процедура выполняется около 24 часов в культуре периода (HH24):
- Подготовка сверху узлов ~ 0,5 мм в диаметре использованием 10-0 нейлона хирургический шов.
- С тонкой щипцы, локально удалить хориона и аллантоиса мембран над эмбрионом и поднимите эмбриона со спины, чтобы повернуть его вертикально так, что левая сторона эмбриона видна.
- Использование тонких щипцы, удалите перикарда через левое предсердие.
- Совместите узел на левом предсердии и затяните его. Узел должен быть связан с тем чтобы запретить ~ 75% от первоначальной приток крови к левой стороне. Вырезать края узел с microscissors и осторожно удалить и уничтожить избыток шва.
- Поворот эмбрион возвращается к своей первоначальной ориентацией (справа сверху).
- Шам контроля будет включать в себя ту же процедуру, но шов будет просто проходили через и не связаны. Эффективное лечение LAL (75% сужения) будет утвержден на 24 часа после операции, и дисквалифицирован эмбрионы будут исключены.
Рисунок 5:. Контроля и левого предсердия лигируют куриного эмбриона Стрелка показывает левого предсердия, что составляет около 75% меньше, в лигируют эмбриона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптический доступ и экспериментов в птичьего эмбриона является сложной задачей из-за ограничений яичной скорлупы. Windowing существенно ограничивает число микрососудов доступным для инъекций и микрохирургические подходы 8. В результате только ранних эмбрионов можно манипулировать и непрерывного наблюдения не представляется возможным. Рано экс-ово культур в чашки Петри были ограниченное применение из-за недостаточного контроля за поверхностного натяжения на эмбрион предотвратить долгосрочные культуры 9. Недавно мы усовершенствовали этот метод использования гексагональной весят лодку, которая сохраняет приемлемый tenstion поверхности 7, но эти культуры было трудно перевозить. Техники, представленные здесь решает эту проблему и значительно расширяет тип экспериментальные методы и методы визуализации, которые могут быть использованы в том числе микроинъекции и хирургических процедур. Как показали исследования фокусируется на понимании позже морфогенный события, этот метод даст возможность мониторинга и модуляции развития событий, которые в настоящее время невозможно экспериментально изучать постоянно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
